液態發酵雞樅菌的條件優化

趙志琴，張 寧，王 晨，呂榮玉，范志華,2,*，孫 溪,2

（1.天津農學院食品科學與生物工程學院，天津 300392；2.天津市農副產品深加工技術工程中心，天津 300392）

雞樅菌（Collybia albuminosa）屬傘菌亞綱傘菌目蟻巢傘屬[1]，又名雞宗、雞絲菇、蟻縱等，夏秋季生長于白蟻巢，并且必須與白蟻共生。雞樅菌含有較高含量的多糖、多種氨基酸，以及K、Fe、Cu 等多種礦物質元素[2-3]，是一種珍貴的食藥真菌[4-5]。雞樅菌主要分布在我國高海拔的西南、東南地區，如云南、貴州、四川、西藏等省區，我國臺灣地區也有分布[6]。

研究表明，多糖具有多種生理功能，如降血脂、預防動脈硬化[7]、抗菌消炎、抗氧化[8]、保護肝臟等，尤其具有抗腫瘤和增強機體免疫力的作用[9]。從20 世紀60 年代開始，多糖活性得到國內外深入的研究，多糖的營養保健、輔助治療等功能突出，富含多糖的各種天然食品受到人們的推崇。雞樅菌多糖主要是從菌絲體[10]和子實體[11]中提取，其生物多糖常見的提取方法有水提法、酸提法等[12]。王化遠等[13]測定出雞樅菌菌絲體中多糖含量達6.33%。近年研究發現，超聲波[14]和微波輔助提取[15]均能提高多糖得率。張恒等[16]優化了超聲輔助提取雞樅菌多糖工藝，并對其抗氧化特性進行研究，結果表明：雞樅菌中生物多糖具有較強的抗氧化特性，這也是雞樅菌具有一定的醫療保健作用的原因之一。

多年來，雞樅菌以采集野生為主[17]。由于生物多樣性的變化，導致野生雞樅菌的生存壓力不斷加大，這給野生雞樅菌資源收集帶來巨大危機。此外，從相關雞樅菌資料來看，國外尚未有人工栽培雞樅菌的成功案例。至今國內市場上也沒有人工栽培成功并批量生產，表明人工栽培雞樅菌存在一定難度[18]。另外，相比傳統栽培，菌種液態發酵是一種更高效且更易于控制的方式[19]。因此，采用液態發酵法對雞樅菌資源開發和針對提高其生物多糖含量開展研究具有重要意義。本研究以單因素試驗為基礎，通過響應面分析法探究提高雞樅菌生物多糖含量的最佳液態發酵條件，為工廠化生產獲取雞樅菌生物多糖提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 材料與試劑

雞樅菌菌種（Collybia albuminosa TZJ816），由研究單位代謝調控實驗室保存。

葡萄糖、蛋白胨、KH2PO4、MgSO4、NaCl、苯酚、濃硫酸，均為分析純。

馬鈴薯采購于農貿市場。

1.1.2 儀器與設備

DK-S24 水浴鍋：上海精宏實驗設備有限公司；UV-1800 分光光度計：北京普析通用儀器有限公司；H2050R 離心機：長沙高新技術產業開發區湘儀離心機儀器有限公司；SHZ-A 水浴振蕩器，DHP-9162 恒溫培養箱：上海博泰實驗設備有限公司；SCIENTZ-ⅡD超聲波細胞粉碎儀：北京海天友誠科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 培養基配方

綜合馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（CPDA 培養基）：20%馬鈴薯，2.0%葡萄糖，0.5%蛋白胨，0.3%瓊脂，0.5%KH2PO4，0.3%MgSO4。

基礎發酵培養基：20%馬鈴薯，2.0%葡萄糖，0.2%蛋白胨。

液體發酵培養基：20%馬鈴薯，2.0%葡萄糖，0.2%蛋白胨，0.5%KH2PO4，0.3%MgSO4，0.02%NaCl。

1.2.2 雞樅菌培養及生物多糖提取

1.2.2.1 分離純化與種子培養

純化：將雞樅菌菌種接入CDPA 液體培養基中培養1 d 后，利用涂布平板法，吸取1 mL 培養好的菌液置于提前準備好的CDPA 培養基中，將培養基放置在23 ℃恒溫條件下培養，待長出白色菌絲，挑取其單菌落劃線分離純化，待菌絲滿管后置于4 ℃環境下保藏備用。

種子培養：挑取雞樅菌菌絲，接入基礎發酵培養基搖瓶（250 mL 三角燒瓶裝液100 mL）中。搖瓶密封后以140 r/min 于26 ℃恒溫搖床中振蕩培養，待出現較多微小菌絲球后置于4 ℃冰箱中保藏備用。

1.2.2.2 液體種培養

分別配制不同碳源添加量、氮源添加量和初始pH 值的液體發酵培養基，將1 mL 液體種接種于液體發酵培養基搖瓶（500 mL 三角燒瓶瓶裝液量為150 mL）中。設置不同的培養時間和培養溫度，搖瓶密封后置于140 r/min 的搖床中振蕩培養。

1.2.2.3 生物多糖的分離提取

對培養結束的液體發酵培養基取樣，體積記為V，3 000 r/min 離心15 min，分離上清液，用于測定胞外總糖，差量法測出沉淀物質量（M0），加入20 倍蒸餾水，超聲波破碎10 min，然后于95 ℃恒溫水浴浸提3 h，再以3 000 r/min 離心10 min，去沉淀，保留上清液，用于測定胞內多糖。

1.2.3 碳源添加量的篩選

使用液態發酵培養基培養雞樅菌，其中葡萄糖作為優先碳源，添加量分別為1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%，pH 值自然，轉速140 r/min，培養溫度26 ℃，培養3 d 后立即測定胞外總糖、胞內多糖含量和菌體單位體積濕重，篩選適宜的碳源添加量。

1.2.4 氮源添加量的篩選

使用液態發酵培養基培養雞樅菌，其中蛋白胨作為優先氮源，添加量分別為0.10%、0.15%、0.20%、0.25%、0.30%，pH 值自然，轉速140 r/min，培養溫度26 ℃，培養3 d 后立即測定胞外總糖、胞內多糖含量和菌體單位體積濕重，篩選適宜的氮源添加量。

1.2.5 單因素試驗設計

1.2.5.1 培養時間的篩選

選擇液體發酵培養基培養雞樅菌，轉速140 r/min，培養溫度26 ℃，pH 值自然，分別培養1、3、5、7、9 d，測定胞外總糖、胞內多糖含量和菌體單位體積濕重，篩選適宜培養時間。

1.2.5.2 發酵液初始pH 值的篩選

選擇液體發酵培養基培養雞樅菌，轉速140 r/min，培養溫度26 ℃，初始pH 值為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0，培養3 d 后立即測定胞外總糖、胞內多糖含量和菌體單位體積濕重，篩選適宜的發酵液初始pH 值。

1.2.5.3 培養溫度的篩選

液態發酵培養基培養雞樅菌，轉速140 r/min，pH值自然，培養溫度分別為22、24、26、28、30 ℃，培養3 d 后立即測定胞外總糖、胞內多糖含量和菌體單位體積濕重，篩選適宜的培養溫度。

1.2.6 響應面法優化試驗設計

通過單因素試驗，確定出培養條件的大致水平，以培養時間、培養溫度、初始pH 為主要影響因素，以雞樅菌多糖含量為響應值，根據Box-Benhnken 中心組合試驗設計原理，采用Design-Expert 11.0 軟件進行三因素三水平試驗[21]，確定液態培養雞樅菌的最佳培養條件。響應面試驗因素與水平見表1。

表1 響應面試驗因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface experiment

1.2.7 測定項目與方法

1.2.7.1 菌體單位體積濕重

采用離心法測定。計算公式如下：

式中：ρ 為菌體濕重，g/L；M0離心后菌體質量，g；V 為培養結束后的培養基的取樣體積，L。

1.2.7.2 胞外總糖、胞內多糖含量

以葡萄糖計，采用硫酸苯酚法[20]測定。稱取葡萄糖0.1 g，轉移到50 mL 容量瓶中，加蒸餾水定容至刻度，得到濃度為2 mg/mL 的葡萄糖溶液，再取葡萄糖溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 于試管中，加蒸餾水至2 mL，得到濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL 的葡萄糖溶液，加入5%苯酚1.0 mL，3.0 mL 濃硫酸，搖勻，靜置5 min，沸水浴15 min，冷卻至室溫。以空白為對照，在490 nm 處測定吸光度。以葡萄糖質量濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制標準曲線（圖1），得到回歸方程：y=0.681 6x+0.057 5，R2=0.998 5。取待測液0.2 mL，用蒸餾水稀釋成2 mL，按照上述方法測定雞樅菌胞外總糖、胞內多糖含量。

圖1 測定雞樅菌生物多糖（以葡萄糖計）含量的標準曲線Fig.1 Standard curve for determination of biological polysaccharide content(calculated by glucose)of Collybia albuminosa

1.2.8 數據處理

采用SPSS26.0 軟件對數據進行分析，利用Design-Expert 11.0 軟件進行響應面試驗的設計與分析。

2 結果與分析

2.1 優先碳源添加量對雞樅菌液胞外總糖、胞內多糖含量和單位體積濕重的影響

如圖2 所示，葡萄糖添加量低于2.5%時，隨著葡萄糖添加量的增加，菌體單位體積濕重和胞內多糖含量呈逐漸上升趨勢，胞外總糖含量呈下降趨勢，此時雞樅菌可能處于對數期和穩定前期，作為優先碳源利用，呈現葡萄糖效應；葡萄糖添加量為2.5%時，胞內多糖含量達到最大值3.23 g/L；葡萄糖添加量高于2.5%時，菌體單位體積濕重和胞內多糖呈下降趨勢，胞外多糖呈上升趨勢，此時雞樅菌處于穩定后期和逐漸進入衰亡期，代謝產物可能會引起反饋調節，葡萄糖消耗量較少，或者葡萄糖添加量超過2.5%抑制了雞樅菌的生長，造成雞樅菌死亡。因此，葡萄糖添加量為2.5%時，最適合雞樅菌的生長，此結論與王坤等[22]的結論相似。

圖2 葡萄糖添加量對雞樅菌液胞外總糖、胞內多糖含量和單位體積濕重的影響Fig.2 Effect of glucose addition on extracellular total sugar,intracellular polysaccharide contents and wet weight per unit volume in Collybia albuminosa fermentation liquid

2.2 優先氮源添加量對雞樅菌液胞外總糖、胞內多糖含量和單位體積濕重的影響

由圖3 可以看出，蛋白胨添加量低于0.25%時，菌體單位體積濕重和胞內多糖含量隨蛋白胨添加量的增加呈上升趨勢，胞外總糖含量呈下降趨勢，可能是蛋白胨含量過低不能支持雞樅菌的生長，當蛋白胨含量增加時，雞樅菌生長加快，菌絲體開始積累，胞外總糖逐漸被消耗；當蛋白胨添加量為0.25%時，菌體單位體積濕重達到最大值27 g/L，此時菌絲體產生量最多；但蛋白胨添加量超過0.25%后，菌體單位體積濕重和胞外多糖含量呈下降趨勢，胞內多糖含量呈上升趨勢。這是因為蛋白胨添加過量可能抑制雞樅菌的生長，或者使雞樅菌破壁死亡，也可能在雞樅菌生長后期，菌種處于老化階段。由此可見，氮源添加量為0.25%時最適合雞樅菌的生長。

圖3 氮源添加量對雞樅菌液胞外總糖、胞內多糖含量和單位體積濕重的影響Fig.3 Effect of nitrogen addition on extracellular total sugar,intracellular polysaccharide contents and wet weight per unit volume in Collybia albuminosa fermentation liquid

2.3 單因素試驗結果

2.3.1 培養時間對雞樅菌液胞外總糖、胞內多糖含量和單位體積濕重的影響

如圖4 所示，雞樅菌單位體積濕重呈現先升高后降低的趨勢，接種孢子培養7 d，雞樅菌單位體積濕重積累達到峰值，為23 g/L。培養前期（0～3 d），雞樅菌快速生長，以消耗碳源為主；進入旺盛期至穩定期（3～7 d），代謝較為旺盛，碳源氮源消耗最大，菌絲積累較多，胞外總糖和胞內多糖出現極值；培養7 d 后，進入衰亡期，細胞可能破壁自溶而溶出多糖。因而雞樅菌培養液離心測定上清液胞外總糖含量呈現先降低后升高的趨勢，而胞內多糖含量反之，說明雞樅菌較為適宜的培養時間為7 d。

圖4 培養時間對雞樅菌液胞外總糖、胞內多糖含量和單位體積濕重的影響Fig.4 Effect of culture time on extracellular total sugar,intracellular polysaccharide contents and wet weight per unit volume in Collybia albuminosa fermentation liquid

2.3.2 初始pH 對雞樅菌液胞外總糖、胞內多糖含量和單位體積濕重的影響

由圖5 可見，初始pH 從5 升高到6，雞樅菌單位體積濕重和胞內多糖含量呈上升趨勢，胞外多糖含量呈下降趨勢。羅海凌等[23]研究表明，pH 值對食用菌菌絲生長影響較大。本試驗中初始pH 值從5 升至6時，菌體單位濕重呈先增加后減小的趨勢，說明雞樅菌不適合強酸性條件下生長；初始pH 值超過6，雞樅菌單位體積濕重和胞內多糖均呈下降趨勢，胞外多糖呈上升趨勢，說明初始pH＞6 已經不適合雞樅菌的生長，此時雞樅菌生長代謝緩慢。因此，pH=6 最適合雞樅菌的生長。

圖5 初始pH 對雞樅菌液胞外總糖、胞內多糖含量和單位體積濕重的影響Fig.5 Effect of initial pH on extracellular total sugar,intracellular polysaccharide contents and wet weight per unit volume in Collybia albuminosa fermentation liquid

2.3.3 培養溫度對雞樅菌液胞外總糖、胞內多糖含量和單位體積濕重的影響

由圖6 可見，當培養溫度低于26 ℃時，雞樅菌單位體積濕重和胞內多糖含量呈上升趨勢，胞外總糖含量呈下降趨勢，這是因為培養溫度較低，雞樅菌活性較低，生長速度較慢；隨著培養溫度的升高，雞樅菌活性增強，26 ℃時雞樅菌單位體積濕重達到最大值25 g/L，胞外總糖含量達到最小值1.012 g/L，胞內多糖含量達到最大值2.76 g/L；當培養溫度高于26 ℃時，雞樅菌單位體積濕重和胞內多糖含量呈下降趨勢，胞外總糖含量呈上升趨勢，這是因為培養溫度過高會造成雞樅菌活性下降或失活，其利用培養基中葡萄糖的能力降低。說明培養溫度為26 ℃時最適合雞樅菌的生長。

圖6 培養溫度對雞樅菌液胞外總糖、胞內多糖含量和單位體積濕重的影響Fig.6 Effect of culture temperature on extracellular total sugar,intracellular polysaccharide contents and wet weight per unit volume in Collybia albuminosa fermentation liquid

2.4 響應面優化結果

2.4.1 響應面試驗結果與方差分析

試驗以隨機次序進行，將試驗所得的多糖含量用Design-Expert 11.0 軟件進行分析，并得出響應面分析圖、回歸擬合方程，以及方差分析表。響應面試驗設計與結果見表2。

通過對表2 試驗數據進行分析，擬合得出關于培養時間（X1）、培養溫度（X2）、初始pH（X3）的二次多項式方程：

表2 中心組合設計試驗結果Table 2 Experimental results of central combination design

對模型進行方差分析，結果見表3。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Regression model variance analysis

由表3 可知，該回歸模型是極顯著的（P＜0.01），X1對響應值影響顯著（P＜0.05），X2、X3、X1X3、X21、X22對響應值影響極顯著（P＜0.01），X1X2、X2X3、X23對響應值影響不顯著，同時由各因素均方值可以得出影響雞樅菌生物多糖含量的各因素排序為：X3＞X2＞X1。該模型失擬項P 值為0.592 7，失擬項用來表示所用模型與試驗擬合的程度，這意味著失擬項是不顯著的，即模型與試驗值的差異較小。同時模型的決定系數R2＝0.962 6，說明雞樅菌生物多糖含量的試驗值與預測值之間有很好的擬合度。

2.4.2 各因素交互作用的響應面分析

響應面圖形是響應值Y 對各試驗因子X1、X2、X3的函數圖形，從響應面圖形上可以形象地看出最佳參數及各參數之間的相互作用[24]。響應面分析等高圖直觀地反映出各因素交互作用對響應值的影響[25]。圖8～10中的響應面展示了某兩個因素的交互作用對液體培養雞樅菌生物多糖含量的影響。由等高線圖可知，多糖含量Y 存在最高值，各因素均有一個對應的最適值。

圖7 培養時間與培養溫度的交互作用對雞樅菌多糖含量影響的響應面圖Fig.7 Response surface diagram of effect of culture time and temperature interaction on polysaccharide content in Collybia albuminosa

圖8 培養溫度與初始pH 的交互作用對雞樅菌多糖含量影響的響應面圖Fig.8 Response surface diagram of effect of culture temperature and initial pH interaction on polysaccharide content in Collybia albuminosa

圖9 培養時間與初始pH 的交互作用對雞樅菌多糖含量影響的響應面圖Fig.9 Response surface diagram of effect of culture time and initial pH interaction on polysaccharide content in Collybia albuminosa

2.4.3 最佳培養條件的確定

對方程進行最優求解得到，培養條件的最優組合為：培養時間7.65 d，培養溫度27.60 ℃，初始pH為7，預測的生物多糖含量為2.67 g/L。考慮到實際操作，將最優解修正，即：培養時間8 d，培養溫度27.60 ℃，初始pH 為7。為了檢驗優化結果的可靠性，采用修正后的組合條件進行3 次平行試驗，得出雞樅菌生物多糖平均含量為2.71 g/L，與理論預測值2.67 g/L基本吻合。因此，利用響應面分析法優化得到的雞樅菌的培養條件真實可靠，具有很好的實用價值。

3 結論

在單因素試驗的基礎上，以培養時間、培養溫度、初始pH 為試驗因素，根據Box-Benhnken 中心組合試驗設計原理，采用Design-Expert 11.0 軟件進行三因素三水平響應面試驗，以多糖含量為考察指標，對雞樅菌液體培養條件進行優化。響應面試驗得到雞樅菌液體培養的最佳條件為：葡萄糖添加量2.50%，蛋白胨添加量0.25%，培養時間8 d，培養溫度27.6 ℃，初始pH 為7，在此條件下，雞樅菌生物多糖含量為2.71 g/L。