誘導富集胞外靈芝酸A 的液態發酵培養基優化

丁 舒，宋兆偉，陳 穎，張志軍，張 峻，陳曉明

（天津市農業科學院農產品保鮮與加工技術研究所，天津 300384）

靈芝屬于多孔菌目靈芝菌科靈芝屬真菌，在我國已有2 000 多年的藥用歷史。我國傳統醫學認為，靈芝具有扶正固本、滋補強壯的作用[1]。現代科學研究證實，靈芝含有多種生理活性成分，如多糖、三萜、核苷、生物堿、蛋白質、甾醇等，其中三萜類化合物具有抗腫瘤、保肝、鎮痛、抗氧化等功效，可用于生產藥用及功能食品，具有廣闊的應用前景。傳統的靈芝三萜類化合物生產方法主要通過靈芝子實體的提取，故受制于靈芝子實體的生產，相對生產周期長且成本較高，采用液態發酵培養靈芝菌絲體并提取其中的活性化合物是一種可行的解決方案。優化適宜的靈芝酸A 誘導富集培養基配方，進行靈芝菌絲液體發酵，工藝流程簡便，易于規范化，可作為生產靈芝酸等胞外活性成分的一種新方法[2]。

在發酵培養基配方和工藝優化研究中，應用響應面法進行優化是一種廣泛采用的方法，能夠獲得最優發酵條件及工藝。魯明等[3]應用響應面法建立了二次多項回歸模型，對黑米乳酸菌飲料感官品質的影響因素進行優化，得到了乳酸菌發酵黑米飲料的最佳工藝條件。岳鹍等[4]設計響應面試驗建立二次回歸模型，考察了發酵初始pH、發酵溫度、固液質量體積比及發酵時間4 個因素對發酵產酶的影響。辛宇等[5]采用雙向固體發酵技術，利用響應面法設計試驗篩選出了穩定可行、重復性好的冬蟲夏草發酵人參工藝。閆舒雅等[6]通過響應面法優化了樺褐孔菌發酵生產多糖的工藝條件，為多糖的大量制備提供參考。在食藥用菌液態發酵和富集生產活性物質的研究中，也經常應用響應面法設計試驗，優化培養基和發酵條件。曾璇竹等[7]研究了富硒香菇多糖的發酵富集及其抗氧化活性，通過響應面法確定最優發酵條件，在優化后的發酵條件下得到的富硒香菇多糖具有較好的抗氧化活性。吳琪等[8]通過響應面法優化了巴西蘑菇的液體發酵培養基配方，得到最大菌絲生物量為17.85 g·L-1。張忠等[9]使用猴頭菌液體發酵生產麥角甾醇，經響應面分析優化試驗，發現培養基中氮源對麥角甾醇產量的影響極顯著，對麥角甾醇產量的影響程度為：氮源＞碳源＞無機鹽。

參考已有經驗，基于課題組前期研究方法和成果[10]，本研究以液態發酵靈芝菌絲誘導富集靈芝酸A，采用全合成培養基替代傳統的天然原料培養基，原料來源穩定，適用性強，無毒無害，安全簡便，更有利于工業化應用。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 材料與試劑

菌種：靈芝（Ganoderma lucidum）G8，保藏于天津市食用菌技術工程中心，接種于馬鈴薯綜合培養基（Comprehensive Potatoes Dextrose Agar，CPDA）[11]試管斜面，于4 ℃冰箱中恒溫保存。

葡萄糖（生物試劑（BR））、麥芽糖（BR）、木聚糖（BR）、果糖（BR）纖維素（BR）、糊精（BR）、谷氨酸（BR）、天門冬氨酸（BR）、精氨酸（BR）、賴氨酸（BR）、組氨酸（BR），D-木糖（（分析純）AR）、淀粉（AR），國藥集團化學試劑有限公司；蔗糖（BR）、乳糖（BR），牛磺酸（AR），天津大茂化學試劑有限公司；菊糖（BR）、復合維生素B 族（原料藥），河南特康生物科技有限公司；靈芝酸A（Ganoderic acid A）（光譜純（SP）），四川維克奇生物科技有限公司。

1.1.2 儀器與設備

PHS-3C 型pH 計，上海儀電科學儀器股份有限公司；FA-2004C 型分析天平，上海恒平科學儀器有限公司；TU-1810 型紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；HS-211C 型恒溫搖床，上海和呈儀器制造有限公司；SHP-250 型生化培養箱和DHG-9203A 型電熱鼓風干燥箱，上海培因實驗儀器有限公司；SW-CJ-2FD 型超凈工作臺，蘇州凈化設備有限公司；CT62A 型滅菌鍋，馳通儀器(上海)有限公司；MT-30K 型組織破碎機，杭州米歐儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 培養基配方及配制方法

菌種培養基采用CPDA 培養基，配方為：土豆200 g（浸汁），葡萄糖20 g，酵母浸膏1 g，KH2PO43 g，MgSO4·7H2O 1.5 g，VB10.05 mg，瓊脂16 g，蒸餾水1 000 mL。采用5%NaOH 及5%HCl 調節pH 至6.4。

1 級、2 級搖瓶種子培養基采用改良的綜合培養基（Comprehensive Medium，CM），配方為：葡萄糖20 g，蛋白胨2 g，酵母浸粉1 g，KH2PO40.46 g，K2HPO41 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，VB10.05 mg，蒸餾水1 000 mL。采用5%NaOH 及5%HCl 調節pH 至6.4[12-14]。

合成培養基為課題組自行研制，配方為：葡萄糖30 g，組氨酸0.5 g，復合VB（Compound Vitamins B，CVB）1 mL（包含VB13 mg、VB21.5 mg、VB60.2 mg、煙酰胺10 mg、泛酸鈣1 mg），牛磺酸0.1 g，蒸餾水1 000 mL。采用5%NaOH 以及5%HCl 調節pH 至6.4。

培養基配制方法：將各培養基配方所述成分稱量后，攪拌至充分溶解并定容至1 000 mL，分裝至250 mL 廣口三角瓶中，每瓶80 mL，棉塞封口后，表面加蓋雙層牛皮紙，于121 ℃滅菌30 min，冷卻，置于超凈工作臺中直至封口材料完全干燥后備用。

1.2.2 菌種的制備

1.2.2.1 母種的活化和制備

取保藏的靈芝菌種，于25 ℃活化48 h，鏟取0.5 cm2大小的方塊接種于菌種培養基平板表面，于25 ℃避光培養5 d，經無菌檢查后備用[14]。

1.2.2.2 1 級搖瓶種子的制備

活化菌種菌落生長直徑達5 cm 時，鏟取0.5 cm2大小的小方塊接種于1 級搖瓶種子培養基中，每瓶接種3 個小方塊。置于恒溫搖床中，160 r/min，25 ℃避光培養5 d 至出現菌絲球，酚紅肉湯無菌檢查后備用[14]。

1.2.2.3 2 級搖瓶種子的制備

1 級搖瓶種子培養5 d，過40 目滅菌尼龍篩至無菌三角瓶中，以移液槍吸取5 mL 濾液，接種于2 級搖瓶種子培養基中，160 r/min，25 ℃避光培養7 d，用組織破碎機打碎菌絲球成均勻菌絲體，用無菌20目滅菌尼龍布過濾后，將菌絲體重懸于無菌水中，160 r/min 搖動5 min，反復3 次，去除菌絲體上殘余培養基，用蒸餾水調整菌絲生物量至10 g/L，重懸于蒸餾水中，經酚紅肉湯無菌檢查后備用。

1.2.2.4 測試培養基的接種與培養

將懸浮于蒸餾水中的二級搖瓶種子以移液槍吸取20 mL，無菌加入預先滅菌分裝的各測試培養基處理，160 r/min、25 ℃避光培養10 d。

1.2.2.5 對照培養基的接種與培養

對照培養基為CM 培養基，其接種與培養方法同“1.2.2.4”。

1.2.3 靈芝菌絲生物量（以下簡稱靈芝生物量）的測定

使用濾紙過濾法對各處理培養基中菌絲體生物量進行測定。將搖瓶培養結束后的發酵液用經100 ℃烘干至恒重、并準確稱重編號的雙層定性濾紙抽濾，用蒸餾水洗滌沉淀3 次，80 ℃烘干至恒重，分析天平稱重并減去對應濾紙的皮重，得菌絲生物量干重，將其換算為g/L 進行后續數據分析。

1.2.4 pH 值的測定

使用酸度計測定發酵液pH 值，具體方法參照GB/T 6920—1986《水質pH 值的測定 玻璃電極法》[15]，同一樣品重復測定3 次，結果取平均值。

1.2.5 靈芝酸A 產量的測定

1.2.5.1 靈芝胞外靈芝酸A 的提取

在去除菌體后的發酵液中加入4 倍體積冷95%乙醇進行沉淀，除去多糖，將上清液濃縮直至完全干燥，再用蒸餾水懸浮，加10 mL 氯仿萃取。重復3 次后合并萃取液，加10 mL 5%NaHCO3溶液，于漩渦振蕩混合器中萃取氯仿提取液中的靈芝酸A，萃取3 次，合并萃取液，用稀鹽酸調pH 值至3，移至離心管中，再反復用氯仿萃取3 次，每次用10 mL 氯仿。合并氯仿萃取液，待氯仿完全揮發后，用無水乙醇溶解，定容至10 mL 容量瓶中。

1.2.5.2 靈芝胞外靈芝酸A 產量的測定

采用紫外分光光度法測定，以靈芝酸A 為標準品，具體方法參考文獻[16-17]。

1.2.6 液態發酵培養基響應面法優化試驗設計

通過前期試驗篩選合成培養基各主要成分的適宜濃度范圍，包括：碳源為25～35 g·L-1葡萄糖，氮源為0.3～0.7 g·L-1組氨酸，生長因子為20～40 g·L-1復合VB。

以葡萄糖添加量（A）、組氨酸添加量（B）、復合VB 添加量（C）為自變量，以發酵結束后發酵液菌絲生物量（Y1）和靈芝酸A 產量（Y2）為響應變量，設計響應面分析試驗，其因素水平見表1。

表1 響應面試驗因素水平表Table 1 Factors and levels of RSM design

1.2.7 數據處理

根據Box-Benhnken（BBD）中心組合方法，使用Design-Expert 10 軟件進行試驗設計與數據分析。

2 結果與分析

2.1 響應面試驗設計及結果

采用響應面法對液態發酵培養基配方進行優化，試驗方案設計及結果見表2。

表2 響應面試驗設計與結果Table 2 Design and results of RSM test

2.2 回歸模型的建立及方差分析

對表2 中的數據進行多元線性回歸擬合，得到靈芝生物量（Y1）與葡萄糖添加量（A）、組氨酸添加量（B）、復合VB 添加量（C）的二次多元回歸方程為：Y1=-54.31+2.78A+73.90B+0.14C-0.28AB+0.01AC -0.15BC-0.05A2-57.96B2。

靈芝酸A 產量（Y2）與葡萄糖添加量（A）、組氨酸添加量（B）、復合VB 添加量（C）的二次多元回歸方程為：Y2=-254.64+12.62A+408.03B+4.84C+6.85AB+0.21BC+0.31AC-0.36A2-634.20B2-0.18C2。

對上述回歸模型進行方差分析，結果見表3～4。

由表3 可知，以靈芝生物量為響應值的模型1 極顯著（P＜0.01），失擬項不顯著，表明該回歸模型方程的擬合度良好。該模型的R2為0.990 1，調整后R2adj為0.977 4，模型1 可以解釋97.74%的靈芝生物量的變化，說明可以用模型1 分析和預測液態發酵培養基最優配方。靈芝生物量（Y1）模型中，一次項A、B、C，交互項AC 及二次項A2、B2、C2對靈芝生物量的影響極顯著（P＜0.01），交互項BC 的影響顯著（P＜0.05），交互項AB 的影響不顯著。各因素對靈芝生物量的影響程度由大到小為：A＞B＞C，即葡萄糖添加量＞組氨酸添加量＞復合VB 添加量。

表3 回歸模型1 方差分析結果Table 3 Analysis of variance for regression model 1

由表4 可知，以靈芝酸A 產量為響應值的模型2顯著（P＜0.05），失擬項不顯著，表明模型2 并不理想，但仍有一定的參考價值，尤其是對于不和初生代謝相關的次生代謝產物。該模型的R2為0.835 1，調整后R2adj為0.623 2，二者之間有一定的差距，因此，僅用該模型分析和優化培養基的配方和添加物。靈芝酸A 產量（Y2）模型中，一次項和交互項對靈芝酸A 產量的影響均不顯著。靈芝酸A 為次生代謝產物，其產量的多寡與靈芝菌絲生物量的關系并不密切[18-19]，靈芝酸的代謝受制于更復雜的情況。

2.3 因素間的交互作用分析

根據表3 和表4 的結果，只分析各因素間的交互作用對靈芝生物量（Y1）的影響。根據回歸分析結果，得到葡萄糖添加量與組氨酸添加量（AB）、葡萄糖添加量與復合VB 添加量（AC）、組氨酸添加量與復合VB 添加量（BC）之間的交互作用對靈芝生物量（Y1）的影響，如圖1 所示。由圖1 可見，AC 間的交互作用對靈芝生物量（Y1）的影響達極顯著水平（P＜0.01），這與菌絲的生長狀態相關，較大生物量與碳源有關，促進了菌絲體對生長因子的需求，導致AC 的交互作用極顯著；相比較而言，BC 間的交互作用較弱，達顯著水平（P＜0.05），是由于菌絲對氮源的需求較少且恒定，故而由氮源引起的促生作用不明顯，其交互作用較弱；AB 間的交互作用不顯著，說明雖然AB 的交互作用會影響培養基碳氮比，但培養基各處理已經是基于最優碳氮比的設計，因此碳/氮源各因子的變動無法造成較大的影響。

圖1 各因素間的交互作用對靈芝菌絲生物量影響的響應面圖和等高線圖Fig.1 Response surface and contour plots of effect of various factors interactions on biomass of Ganoderma lucidum mycelium

表4 回歸模型2 方差分析結果Table 4 Analysis of variance for regression model 2

2.4 驗證試驗

根據回歸模型1 分析可知，誘導富集胞外靈芝酸A 的液態發酵培養基最優配方為：葡萄糖35 g，組氨酸0.7 g，復合VB 40 mg。經驗證試驗，采用優化后的配方進行靈芝液體發酵，檢測得到菌絲生物量為11.45 g·L-1，靈芝酸A 產量為137.98 mg·L-1。

3 結論

本研究通過響應面法優化誘導富集胞外靈芝酸A 的液態發酵培養基配方為：葡萄糖35 g，組氨酸0.7 g，復合VB 40 mg，牛磺酸0.1 g，蒸餾水1 000 mL。用5% NaOH 及5% HCl 調節pH 至6.4，121 ℃條件下高壓蒸汽滅菌30 min。在此培養基上進行靈芝液體發酵，菌絲生物量為11.45 g·L-1，靈芝酸A 的產量為137.98 mg·L-1。