表面活性劑協同超聲提取杠板歸中 總黃酮及抗氧化活性研究

劉佳豪，李 磊，彭 林

（邵陽學院 食品與化學工程學院，湖南邵陽 422000）

杠板歸又名貫葉蓼、蛇倒退等，屬于蓼科蓼屬（Polygonaceae）植物。杠板歸不僅能被加工成可口的菜肴，還是飼養牲畜的優質植物，是一種集食、飼于一身的植物。經研究發現，杠板歸中的黃酮能清除自由基，具有一定的抗氧化活性，因此杠板歸可作為天然抗氧化劑的來源應用于食品等方面，如從杠板歸中提取出的黃酮搭配維生素C、維生素E組成抗氧化活性更高的物質[1-2]。杠板歸在我國產量大、生長范圍廣，但沒有被大量開發利用，所以需要加強對杠板歸的研究，擴大杠板歸的應用范圍，優化產業結構。目前，杠板歸中總黃酮的提取方法有纖維素酶解法、乙醇回流提取法、超聲提取法和微波提取法等，還沒有利用表面活性劑或離子液體輔助超聲提取法相結合的有關研究[3-5]。表面活性劑超聲波協同輔助提取杠板歸中的黃酮類物質，能更大程度上使黃酮類物質析出，提高提取效率。經過單因素試驗，對表面活性劑輔助超聲提取杠板歸中總黃酮類化合物的條件篩選，得到最佳提取條件，并探究杠板歸黃酮提取物體外抗氧化活性，為杠板歸在食品抗氧化劑中的應用提供理論 依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

杠板歸，湖南省邵陽市本地采摘；蘆丁標準品；無水乙醇、硝酸鋁、亞硝酸鈉、氫氧化鈉、十二烷基硫酸鈉、十二烷基硫酸銨、十二烷基苯磺酸鈉、十六烷基三甲基氯化銨、十八烷基三甲基氯化銨、聚乙二醇600、維生素C和1,1-二甲基-2-三硝基苯肼，均為分析純。

1.2 儀器與設備

DZ-2BC型真空干燥箱，天津市泰斯特儀器有限公司；SB-4200型超聲波清洗器，寧波新芝生物科技股份有限公司；UV-2600型紫外可見分光光度計，日本島津儀器有限公司；FW400A型高速萬能粉碎機，北京科偉永興儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 杠板歸樣品預處理

取適量杠板歸，曬干、粉碎，過80目篩，真空干燥后放入密封袋中保存備用。

1.3.2 溶液的制備

①蘆丁標準溶液。精密稱取干燥后的蘆丁對照品10 mg置于燒杯中，以70%乙醇溶解并定容至 50 mL容量瓶，搖勻，得質量濃度為0.2 mg/mL的蘆丁標準溶液。②亞硝酸鈉溶液。稱取2.50 g NaNO2固體，定容至50 mL容量瓶，制得5%的亞硝酸鈉溶液。③硝酸鋁溶液。稱取5.00 g Al(NO3)3固體，定容至50 mL容量瓶，制得10%的硝酸鋁溶液。④氫氧化鈉溶液。稱取2.00 g NaOH固體，定容至50 mL容量瓶，制得4%的氫氧化鈉溶液。

1.3.3 蘆丁標準曲線的繪制

精確吸取0 mL、0.25 mL、0.50 mL、1.00 mL、 1.50 mL、2.00 mL、2.50 mL和3.00 mL放入10 mL容量瓶中，加5%的亞硝酸鈉溶液0.3 mL，靜置6 min； 加入10%的硝酸鋁溶液0.3 mL，靜置6 min；再加4%的氫氧化鈉溶液2.0 mL，最后以70%的乙醇溶液定容至10 mL刻度線搖勻，靜置15 min[6-7]。

以試劑空白作為參比，在波長為510 nm處測定不同濃度蘆丁標準溶液的吸光度，以蘆丁標準液的濃度作為橫坐標，相應的吸光度值為縱坐標，繪制蘆丁標準曲線。

1.4 單因素試驗

1.4.1 表面活性劑種類對提取率的影響

稱取7份5.000 g杠板歸置于7個錐形瓶中，分別加入質量分數為1%（0.050 0 g）的表面活性劑。表面活性劑種類為十二烷基硫酸鈉、十二烷基硫酸銨、十二烷基苯磺酸鈉、十六烷基三甲基氯化銨、十八烷基三甲基氯化銨、聚乙二醇600以及空白組。用70%乙醇溶液定容，料液比為1∶20（g∶mL），40 ℃下超聲提取60 min，抽濾得杠板歸黃酮提取液。將提取液定容至100 mL，取5.0 mL杠板歸黃酮提取液置于10 mL容量瓶中，按照1.3.3的操作步驟測吸光度，計算出總黃酮得率。

1.4.2 表面活性劑用量對提取率的影響

稱取8份5.000 g杠板歸置于8個錐形瓶中，分 別 加 入0.025 0 g（0.5%）、0.050 0 g（1.0%）、 0.075 0 g（1.5%）、0.100 0 g（2.0%）、0.125 0 g（2.5%）、0.150 0 g（3.0%）、0.175 0 g（3.5%）和0.200 0 g（4.0%）十八烷基三甲基氯化銨，用70%乙醇溶液定容，料液比為1∶20（g∶mL），40 ℃下超聲提取60 min， 抽濾得杠板歸黃酮提取液。將提取液定容至100 mL， 取5.0 mL杠板歸黃酮提取液置于10 mL容量瓶中，按照1.3.3的操作步驟測吸光度，計算出總黃酮得率。

1.4.3 乙醇濃度對提取率的影響

稱取6份5.000 g杠板歸置于6個錐形瓶中，加入質量分數為3%的十八烷基三甲基氯化銨，錐形瓶中分別加入濃度不同的乙醇溶液，乙醇濃度分別為50%、60%、70%、80%、90%和100%，料液比為1∶20（g∶mL），40 ℃下超聲提取60 min，抽濾得杠板歸黃酮提取液。將提取液定容至100 mL， 取5.0 mL杠板歸黃酮提取液置于10 mL容量瓶中，按照1.3.3的操作步驟測吸光度，計算出總黃酮 得率。

1.4.4 超聲時間對提取率的影響

精確稱取7份5.000 g杠板歸置于7個錐形瓶中，分別加入質量分數為3%的十八烷基三甲基氯化銨，用70%乙醇溶液定容，料液比為1∶20（g∶mL），40 ℃下超聲提取。分別在30 min、40 min、50 min、60 min、70 min、80 min和90 min時取出一個錐形瓶，做好標記，超聲處理后抽濾得杠板歸黃酮提取液。將提取液定容至100 mL，取5.0 mL杠板歸黃酮提取液置于10 mL容量瓶中，按照1.3.3的操作步驟測吸光度，計算出總黃酮得率。

1.4.5 超聲溫度對提取率的影響

精確稱取6份5.000 g杠板歸置于6個錐形瓶中，分別加入質量分數為3%十八烷基三甲基氯化銨，用70%乙醇溶液定容，料液比為1∶20（g∶mL），分別在20 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃和70 ℃下超聲提取70 min，抽濾得杠板歸黃酮提取液。將提取液定容至100 mL，取5.0 mL杠板歸黃酮提取液置于10 mL容量瓶中，按照1.3.3的操作步驟測吸光度，計算出總黃酮得率。

1.4.6 料液比對提取率的影響

精確稱取4份5.000 g杠板歸置于4個錐形瓶中，分別加入質量分數為3%十八烷基三甲基氯化銨，用70%乙醇溶液定容，60 ℃下超聲提取70 min，考察料液比分別為1∶10（g∶mL）、1∶20（g∶mL）、1∶30（g∶mL）和1∶40（g∶mL）時對杠板歸中總黃酮提取率的影響。超聲處理后抽濾得杠板歸黃酮提取液。將提取液定容至100 mL，取5.0 mL杠板歸黃酮提取液置于10 mL容量瓶中，按照1.3.3的操作步驟測吸光度，計算出總黃酮得率。

1.4.7 總黃酮提取率計算

黃酮提取率計算如公式如下：

式中：ρ為由標準曲線方程的提取液所計算得到的樣品黃酮質量濃度，g/L；V0為黃酮提取液的定容體積，L；V1為顯色反應中提取液樣品的定容體積，L；V2為所稱量的提取液樣品的體積，L；m為所稱取的質量，g。

1.5 杠板歸中黃酮類化合物的抗氧化能力測定

1.5.1 樣品制備

精確稱取5.000 g杠板歸粉末置于錐形瓶中，加入質量分數為3%十八烷基三甲基氯化銨，在乙醇濃度為70%，料液比為1∶30，60 ℃下超聲提取70 min， 超聲處理后趁熱抽濾得杠板歸黃酮提取液，藥渣用70%的乙醇溶液沖洗3遍，抽濾、合并收集杠板歸黃酮提取液，旋轉蒸發儀旋干溶液，得到提取浸膏，待用。

1.5.2 DPPH自由基清除

精密稱取避光冷藏的1,1-二甲基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基粉末0.005 0 g，加入無水乙醇溶解，倒入100 mL容量瓶中，用無水乙醇定容，制得 0.05 mg/L DPPH自由基溶液，避光保存，備用。

取杠板歸黃酮提取浸膏，用無水乙醇配制濃度分別為0.4 mg/mL、0.8 mg/mL、1.2 mg/mL、1.6 mg/mL和 2.0 mg/mL的樣品作為杠板歸黃酮提取液，貼好標簽。此外在貼有標簽的試管中分別加入2 mL上述杠板歸黃酮提取液和2 mL 0.05 mg/L的DPPH自由基溶液，將試管放置于自制的避光紙盒中，輕微搖晃使其混合均勻，室溫條件下放置30 min，于517 nm處測得吸光度（A1）；同樣的方法制備樣品對照組，其中采用無水乙醇替代DPPH溶液，貼好標簽（A2）；空白組也是一樣，無水乙醇替代杠板歸黃酮提取液，貼好標簽（A0）。然后根據順序，依次測量各管吸光度值。維生素C為陽性對照。每個測試管做3組平行，結果取平均值。樣品對DPPH自由基清除率的計算公式如下：

式中：A0為2 mL無水乙醇+2 mL DPPH自由基溶液的吸光度值；A1為2 mL杠板歸黃酮提取液 +2 mL DPPH自由基溶液的吸光度值；A2為2 mL杠板歸黃酮提取液+2 mL無水乙醇的吸光度值。

2 結果與分析

2.1 蘆丁標準曲線

蘆丁標準曲線的線性回歸方程為Y=3.774 8X-0.000 7（Y為吸光度，X為濃度，單位為mg/mL），R=0.994 8＞0.99。

2.2 單因素試驗結果分析

2.2.1 表面活性劑對提取率的影響

由圖1可知，在其他條件相同的情況下，加入表面活性劑組比不加表面活性劑的空白組的總黃酮提取率高，說明表面活性劑協同超聲提取杠板歸中總黃酮的效果明顯，其中十八烷基三甲基氯化銨的提取效果最好，總黃酮提取率為5.95%。因此，在后續采用十八烷基三甲基氯化銨協同超聲提取杠板歸中總黃酮。

圖1 表面活性劑種類對提取率的影響

2.2.2 表面活性劑用量對提取率的影響

由圖2可知，開始時杠板歸中總黃酮的提取率隨著十八烷基三甲基氯化銨的質量分數增加而增大，當十八烷基三甲基氯化銨質量分數為3.00%時，提取率達到最大值6.16%，隨后再增加十八烷基三甲基氯化銨的用量，提取率反而降低。這是由于隨著十八烷基三甲基氯化銨用量的增加，溶液中形成的膠束數目增多，對杠板歸中黃酮的增溶作用變強，當達到臨界膠束濃度后，對黃酮的增溶能力變化不大，反而對其他雜質有了一定的增溶作用，從而導致黃酮的得率下降。因此，十八烷基三甲基氯化銨的最佳提取質量分數為3.00%。

圖2 十八烷基三甲基氯化銨的用量對提取率的影響

2.2.3 乙醇濃度對提取率的影響

由圖3可知，隨著乙醇濃度的增大，杠板歸中總黃酮的提取率也相對提高，這是因為杠板歸中的黃酮類化合物在乙醇中的溶解度大于在水中的溶解度，乙醇濃度的增加能夠促進黃酮類化合物的析出。當乙醇濃度達到70%時，提取率達到最大值6.15%，之后再增加乙醇濃度，提取率反而下降，這可能是由于高濃度的乙醇使得杠板歸中醇溶性雜質的溶出率增加，反而抑制杠板歸中總黃酮的提取。因此選擇最佳提取乙醇濃度為70%。

圖3 乙醇濃度對提取率的影響

2.2.4 超聲時間對提取率的影響

由圖4可知，隨著超聲提取時間的延長，杠板歸中總黃酮的提取率也在增加，當時間達到70 min時，杠板歸中總黃酮的提取率達到最大值6.24%。隨后繼續增加超聲時長，總黃酮提取率反而下降，可能是由于長時間的超聲導致醇溶性雜質的溶出率增加，反而抑制杠板歸中總黃酮的提取。因此，選定最佳超聲時長為70 min。

圖4 超聲時間對提取率的影響

2.2.5 超聲溫度對提取率的影響

由圖5可知，隨著溫度的升高，總黃酮提取率也在增加，當溫度升至60 ℃后，提取率達到最大值6.34%，溫度超過60 ℃后，總黃酮提取率反而降低。說明當溫度超過某一臨界值時，會阻礙表面活性劑與杠板歸的結合，導致提取效率降低。因此，設定杠板歸中總黃酮的最佳提取溫度為60 ℃。

圖5 超聲溫度對提取率的影響

2.2.6 料液比對提取率的影響

由圖6可知，隨著料液比的增大，杠板歸中總黃酮提取率呈先增加后降低的趨勢，當料液比為1∶30時總黃酮的提取率達到最大值6.43%。料液比的增加會增加杠板歸與提取液之間的黃酮濃度差，使得提取率增大，隨后再增加料液比，其他雜質也被析出，從而降低黃酮提取率。因此，料液比為1∶30時最佳。

圖6 料液比對提取率的影響

2.3 杠板歸中黃酮類化合物的抗氧化能力測定

由圖7可知，隨著提取物和維生素C濃度的增加，DPPH自由基清除率也逐漸升高，表明兩種物質都具有清除DPPH自由基的能力，并且與濃度相關，隨著樣品濃度的增加，清除作用也不斷增強，具有一定的量效相關性。當濃度達到1.0 mg/mL時，DPPH自由基清除率達到91.7%，與維生素C的清除率幾乎相同，結果表明，杠板歸黃酮提取物對DPPH自由基具有良好的清除能力，具有一定的抗氧化 能力。

圖7 杠板歸黃酮提取物對DPPH自由基清除能力圖

3 結論

表面活性劑協同超聲提取杠板歸中總黃酮產生了明顯的效果，其中增效最明顯的是十八烷基三甲基氯化銨。通過單因素試驗，得到表面活性劑協同超聲波提取杠板歸中總黃酮的最優條件為十八烷基三甲基氯化銨質量分數為3.00%，乙醇濃度為70%，料液比為1∶30，60 ℃下超聲提取70 min，在此條件下，杠板歸中總黃酮提取率為6.43%。與單純的超聲提取法相比，表面活性劑協同超聲提取杠板歸中總黃酮，明顯提高了目標產物的得率，降低了生產成本，具有良好的應用前景。

通過杠板歸總黃酮體外抗氧化驗證，確定了杠板歸中總黃酮的抗氧化能力特征。在DPPH自由基清除中，杠板歸總黃酮提取物在濃度為1.0 mg/mL時，DPPH自由基清除率達到91.7%，與維生素C的清除率幾乎相同。同時發現杠板歸黃酮提取物對DPPH自由基具備一定的清除能力，其清除能力主要依賴于自身的質量濃度，隨著樣品濃度的增大，清除作用也不斷增強，具有一定的量效相關性。對杠板歸黃酮抗氧化性的研究，有助于擴大杠板歸的用途范圍，優化產業結構，為以后的研究提供參考數據。