逆流提取黃芪地上部分浸提酒加工工藝研究

陳曉婷，關 宏，朱金峰，馬淑麗，劉振艷，楊文欽，劉吉成

（齊齊哈爾醫學院，黑龍江齊齊哈爾 161006）

中藥藥酒歷史悠久。中草藥能夠強身健體，且毒副作用小，與酒相溶，酒助藥行，相得益彰，藥酒已成為保健常用的飲品[1-2]。中藥黃芪具有很高的藥用價值和經濟價值，素以“補氣諸藥之最”著稱，是最常用的中藥材，已有2 000多年的藥用歷史，中醫認為黃芪具有補氣健脾、利水消腫、固表止汗和托瘡生肌等功效[3-10]。黃芪屬于多年生藥材，而黃芪的地上部分（莖稈，葉、花和果）每年均可采收，且產量是地下部分（根）的幾倍至十幾倍，卻長期被棄之為廢，沒有被充分利用。根據相關文獻分析，地下及地上部分均含有多糖、皂苷、黃酮等有效成分，且活性成分種類一致、僅在量上略有差異。研究還顯示黃芪地上部分總皂苷、總黃酮含量較高[11-15]。2019年，黑龍江省出臺了與干制黃芪莖葉和干制黃芪花相關的食品安全地方標準，充分證明黃芪地上部分也可作為食品原料進行開發 利用[16-17]。

目前，藥酒常用的制備方法有浸提法、滲漉法、超聲提取法、回流提取法、煎煮法和超濾法等[18-21]， 其中浸提法最為常用。動態逆流提取工藝是將兩個以上的動態提取罐機組串聯，提取溶媒沿著罐組內各罐藥料的溶質濃度梯度逆向地由低向高順次輸送通過各罐，并與藥料保持一定提取時間并多次套 用[22-27]。此技術主要利用了固液兩相中有效成分的濃度梯度差，逐級將藥材中有效成分擴散至起始濃度較低的提取溶劑中，達到最大限度轉移藥材中有效成分的目的。與傳統藥酒浸提的制備方法相比，逆流提取具有提取效率高、提取溶劑少的優勢，連續動態化的提取能適用于工業化的生產。

為此，本研究利用罐組式動態逆流提取工藝和傳統醇浸提法，以黃芪地上部分為原料，對黃芪地上部分提取液進行研究。通過對比黃芪提取液的有效成分總糖、總皂苷和總黃酮的提取率，確定最佳提取工藝。本研究首次將逆流提取方法應用在黃芪地上部分浸提酒的研制，在開發新型功能性食品領域有較好前景。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

干黃芪莖葉，黑龍江省齊齊哈爾市富裕縣；95%食用酒精，大慶博潤生物科技有限公司；香草醛、冰醋酸、高氯酸和濃硫酸（均為分析純），科密歐化學試劑；苯酚（分析純），上海生工生物工程有限公司；葡萄糖（優級純），Acros；黃芪甲苷（純度＞98%）、毛蕊異黃酮（純度＞98%），成都普菲德生物技術有限公司；甲醇（色譜純，迪馬科技）。

1.2 儀器與設備

可見分光光度計，上海精科儀器有限公司；UV2550-紫外可見分光光度計，日本島津公司；SHZ-D循環水式真空泵，石家莊陽星儀器貿易有限公司；MS105DU電子天平，梅特勒-托利多國際貿易有限公司；FA1604電子天平，上海精科儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 黃芪浸提酒中總糖的測定

（1）葡萄糖標準曲線的制備。精密稱取干燥的葡萄糖對照品0.106 0 g，加水制成含葡萄糖0.106 mg/mL的標準使用液。分別吸取使用液0 mL、0.1 mL、 0.2 mL、0.4 mL、0.8 mL和1.2 mL，用蒸餾水定容至 2 mL，得到質量分別為0 mg、0.010 6 mg、0.021 2 mg、 0.042 4 mg、0.084 8 mg和0.127 2 mg的標準系列，以相應試劑為空白，按照可見分光光度法，在波長490 nm處測定吸光度值[28]。以OD490nm為縱坐標，葡萄糖質量（mg）為橫坐標，繪制標準曲線，得到葡萄糖回歸方程Y=5.607 1X+0.020 1（相關系數

R2=0.999 8）。

（2）供試品（黃芪浸提酒）總糖的測定。精密量取供試品溶液2 mL置于25 mL具塞試管中，加入5%苯酚溶液2 mL，混勻。加入10 mL濃硫酸，混勻，沸水浴中煮沸15 min，冷卻后，在可見分光光度計上測定，將測定結果代入標準曲線回歸方程，計算，即得總糖質量。

提取率計算公式為：

1.3.2 黃芪浸提酒中總皂苷的測定

（1）黃芪甲苷標準曲線制備。精密稱取黃芪甲苷5.40 mg，用甲醇制成含黃芪甲苷濃度為0.54 mg/mL的標準使用液，分別吸取標準使用液0.1 mL、0.2 mL、 0.3 mL、0.4 mL和0.5 mL加入10 mL容量瓶，得到質量分別為0 mg、0.054 0 mg、0.108 0 mg、0.162 0 mg、 0.216 0 mg和0.270 0 mg的標準系列，以相應試劑為空白，按照可見分光光度法，在波長540 nm處測定吸光度值[29]。以OD540nm為縱坐標，黃芪甲苷質量（mg）為橫坐標，繪制標準曲線，得到黃芪甲苷回歸方程Y=1.751 9X+0.020 8（相關系數R2=0.996 3）。

（2）供試品（黃芪浸提酒）總皂苷的測定。精密量取供試品溶液0.5 mL置于10 mL具塞試管中，90 ℃水浴至揮干溶劑，加入0.4 mL 5%的香草醛冰醋酸溶液，再加入1.6 mL高氯酸混勻，100 ℃水浴2 min，冷卻5 min,加入冰醋酸8 mL，搖勻，在可見分光光度計上測定，將測定結果代入標準曲線回歸方程，計算，即得總皂苷質量。

提取率計算公式為：

1.3.3 黃芪浸提酒中總黃酮的測定

（1）毛蕊異黃酮標準曲線制備。精密稱取毛蕊異黃酮3.40 mg，用甲醇制成含毛蕊異黃酮0.34 mg/mL的標準使用液，分別吸取使用液0 mL、0.10 mL、 0.15 mL、0.20 mL、0.25 mL和0.30 mL用甲醇定容至10 mL，得到質量分別為0 mg、0.034 0 mg、0.051 0 mg、 0.068 0 mg、0.085 0 mg和0.102 0 mg的標準系列，以相應試劑為空白，按照紫外-可見分光光度法，在波長265 nm處測定吸光度值[30]。以OD265nm為縱坐標，毛蕊異黃酮（mg）為橫坐標，繪制標準曲線，得到毛蕊異黃酮回歸方程Y=7.388 2X+0.022 8（相關系數R2=0.998 0）。

（2）供試品（黃芪浸提酒）總黃酮的測定。直接將供試品加入比色皿在紫外可見分光光度計上測定，將測定結果代入標準曲線回歸方程計算，即得總黃酮質量。

提取率計算公式為：

1.3.4 醇提法單因素試驗

根據常用浸提酒濃度選擇考察的酒精濃度為40%、50%、60%，單次提取時間分別考察了3 h、4 h、5 h，提取次數分別考察了3次、4次、5次，通過總糖、總皂苷、總黃酮的提取率進行分析確定醇浸提法單因素最佳提取條件。

1.3.5 罐組式逆流提取方法

罐組式逆流提取示意圖見圖1。

圖1 罐組式逆流提取示意圖

將干黃芪莖葉剪成1 cm長的小段，取4個6 L不銹鋼桶，分別標識A桶、B桶、C桶和D桶，分別向4個不銹鋼桶中添加100 g干黃芪莖葉。如圖1所示，向A桶添加40%食用酒精4 L，浸泡2 h后，提取4 h，采用真空抽濾方式過濾，收集清液，標記為A1。向A桶第2次添加40%食用酒精4 L，浸泡4 h后，采用真空抽濾方式過濾，收集清液，標記為A2；向B桶添加A桶第2次收集的清液A2，浸泡 6 h后，采用真空抽濾方式過濾，收集清液，標記為B1。向A桶第3次添加40%食用酒精4 L，浸泡4 h后，采用真空抽濾方式過濾，收集清液，標記為A3；再向B桶添加A桶第3次收集的清液A3，浸泡4 h后，采用真空抽濾方式過濾，收集清液，標記為B2；向C桶添加B桶第2次收集的清液B2，浸泡6 h后，采用真空抽濾方式過濾，收集清液，標記為C1。 A桶第4次添加40%食用酒精4 L，浸泡4 h后，采用真空抽濾方式過濾，收集清液，標記為A4；向 B桶添加A桶第4次收集的清液A4，浸泡4 h后，采用真空抽濾方式過濾，收集清液，標記為B3；向C桶添加B桶第3次收集的清液B3，浸泡4 h后，采用真空抽濾方式過濾，收集清液，標記為C2；向D桶添加C桶第2次收集的清液C2，浸泡6 h后，采用真空抽濾方式過濾，收集清液，標記為D1，測定D1收集液。

1.3.6 統計學分析

采用SPSS 23.0軟件進行統計分析，運用兩個獨立樣本t檢驗比較逆流提取法與醇浸提法對總糖、總皂苷、總黃酮提取率的差異，檢驗水準α=0.05，P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 黃芪浸提酒的單因素優化結果

2.1.1 不同酒精濃度對黃芪浸提酒中總糖、總皂苷、總黃酮提取率的影響

分別使用40%、50%、60%食用酒精4 L提取100 g干燥黃芪莖葉，由圖2可知，在酒精度為40%時，總糖、總皂苷、總黃酮提取率均為最高。

圖2 酒精度對黃芪浸提酒中總糖、總皂苷、總黃酮提取率的影響

2.1.2 不同提取時間對黃芪浸提酒中總糖、總皂苷、總黃酮提取率的影響

在40%的酒精濃度下，考察不同提取時間對提取率的影響，由圖3可知，隨著提取時間的延長，提取率也隨之增加，但提取時間對提取率影響較小，提取時間為5 h時總黃酮的提取率最大，總糖和總皂苷在提取時間為4 h和5 h沒有變化，綜合時效考慮，選擇單次的提取時間為4 h。

圖3 提取時間對黃芪浸提酒中總糖、總皂苷、總黃酮提取率的影響

2.1.3 提取次數對黃芪浸提酒中總糖、總皂苷、總黃酮提取率的影響

分別考察提取3次混合液、4次混合液、5次混合液對提取率的影響，由圖4可知，總皂苷和總黃酮在提取4次時提取率最高，確定了提取次數為 4次。

圖4 提取次數對黃芪浸提酒中總糖、總皂苷、總黃酮提取率的影響

2.2 逆流提取法與醇浸提法提取率顯著性分析結果

通過2.1單因素優化的浸提條件，在相同條件下，對逆流提取4次混合液進行4次重復實驗，醇提取混合液進行2次重復實驗，并對兩種提取方法的總糖、總皂苷、總黃酮的提取率進行了比較分析。采用兩個獨立樣本t檢驗比較逆流提取法與醇浸提法提取率的差異。由表1可知，兩種方法中總多糖的提取率差異無統計學意義（t=1.56，P=0.194 5）；總皂苷和總黃酮提取率差異具有統計學意義（t=16.24，P＜0.000 1；t=4.80，P=0.008 7），逆流提取法對總皂苷和總黃酮的提取率優于醇浸提法。

表1 逆流提取法與醇浸提法對總糖、總皂苷和總黃酮提取率的結果

3 結論

本文建立了以黃芪地上部分為原料的浸提酒的逆流提取方法，對比分析了醇提取法和逆流提取法中總糖、總皂苷、總黃酮提取率的差異。結果表明，同樣提取條件下，逆流提取的有效成分總皂苷和總多糖提取率優于普通醇浸提法。該方法首次將逆流提取方法應用在黃芪地上部分浸提酒中，具有提取效率高、節省溶劑的優點，連續動態化的提取，同時能適用于工業化的生產，在開發新型功能性食品領域有較好前景。