磁微粒化學發(fā)光法在食品中 百草枯殘留量檢測的應用研究

唐 潔，莫 緒，張啟韓

（桂林師范高等專科學校，廣西桂林 541199）

截止到2020年，包括中國、英國、歐盟、丹麥、俄羅斯及巴西等20多個國家已經禁止或者嚴格限制使用百草枯。目前國內外應用于禁用農藥殘留的檢測技術為氣相色譜法、液相色譜法、氣相色譜-串聯(lián)質譜法、液相色譜-串聯(lián)質譜法和免疫分析法等[1]。

色譜分析法由于檢測儀器體積龐大，對使用環(huán)境及操作者素質都有非常高的要求，同時檢測時間過長，只適合在特定的實驗室由專業(yè)人員進行操作，難以普及推廣應用；免疫分析法主要根據體外生成原理，利用抗體作為生化探測器實現(xiàn)對農殘的定性和定量分析；其中，采用酶聯(lián)免疫吸附（Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA）、熒光免疫分析（Fluorescence Immunoassay，F(xiàn)IA）進行檢測都查到有相關文獻報道。但食品中農藥殘留的量往往非常低，這些方法由于其檢測靈敏度和精密度偏低，因而檢測結果達不到國家標準要求的檢出率。在免疫分析法中，利用磁微粒化學發(fā)光法技術檢測百草枯農藥殘留還未見報道[2]。

本文采用單克隆抗體、AP酶標記以及磁微粒分離技術，建立了百草枯的磁微粒化學發(fā)光免疫定量檢測方法。該方法是在免疫分析法基礎上發(fā)展起來的集化學發(fā)光、特異性免疫分析及磁微粒分離等技術于一體的新型檢測技術，相對于其他傳統(tǒng)分析方法，該技術具有靈敏度高、檢測范圍寬、檢測結果準確、檢測成本低及易于實現(xiàn)自動化操作等系統(tǒng)性優(yōu)勢，最低可檢測到10-18g量級，能及時有效地為監(jiān)管機構提供監(jiān)測數據，為政府職能部門監(jiān)測和控制農藥濫用提供現(xiàn)實依據[3-5]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

三羥甲基氨基甲烷（Tris），西隴化工股份有限公司；氯化鈉，西隴化工股份有限公司；牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin，BSA），Sigma有限公司；甘露醇，西隴化工股份有限公司；海藻糖，西隴化工股份有限公司；BRONIDOX-L，天津希恩思生化科技有限公司；吐溫20（Tween20），上海聯(lián)邁生物工程有限公司。試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

電子天平：AR224CN（奧豪斯儀器有限公司）；冷凍離心機：SF-TGL-20R（上海菲恰爾）；pH計：Sartoriuspp-20；蛋白測定儀：K9840（山東還能科學儀器有限公司）；集熱試恒溫加熱攪拌器：DF-101S （鄭州長城科工貿有限公司）；細胞破碎儀：SM-650A（南京舜瑪儀器設備有限公司）；制冰機：ZBL-35（上海安亭科學儀器廠）。

1.3 實驗方法

1.3.1 試劑緩沖液配制

依次稱取以上物質溶解到800 mL純化水里，用鹽酸調節(jié)pH值為7.4，并定容為1 000 mL的儲備液備用，分別為Tris（0.01 mol/L）、氯化鈉 （0.15 mol/L）、BSA（0.5 mol/L）、甘露醇（0.5 mol/L）、 海藻糖（0.5 mol/L）、BRONIDOX-L（0.01 mol/L）及Tween20（0.05%）。

1.3.2 檢測試劑盒主要組份的制備

檢測試劑盒主要組份由試劑R1、試劑R2及標準液組成。

（1）PQ試劑R1配制。生產工藝流程如圖1所示，采用抗體偶聯(lián)操作工藝。①取10.00 mL磁珠微球（固體物10%），磁分離10 min，棄上清，用100 mL 0.5 mol/L、pH 5.0的MES緩沖液重懸，在混勻儀上混勻10 min；磁分離10 min，棄上清，加入100 mL 0.5 mol/L、PH 5.0的MES緩沖液重懸。②稱取 100 mg N-羥基琥珀酰亞胺（N-hydroxysuccinimide，NHS），用0.5 mol/L、pH為5.0的MES緩 沖 液充分溶解至10.0 mg/mL；稱取50 mg EDC，用 0.5 mol/L、pH為5.0的MES緩沖液充分溶解至 10.0 mg/mL。③在攪拌的條件下，往磁珠微球中先后加入10 mL NHS溶液和5 mL EDC溶液，混勻；④在攪拌的條件下，往磁珠微球中加入百草枯抗體10.00 mg，混勻；⑤磁分離10 min，棄上清，用 100 mL 0.5 mol/L、pH為5.0的MES緩沖液重懸，混勻；⑥磁分離10 min，棄上清，加100.0 mL 10%BSA重懸，混勻；⑦磁分離10 min，棄上清；用100 mL 0.5 mol/L、pH為5.0的MES緩沖液重懸，混勻即得。

圖1 R1生產工藝流程圖

（2）PQ試劑R2配制。R2生產工藝流程如圖2所示， 采用抗原標記操作工藝。①稱取5 mg百草枯化合物，12 mg DSS，用200 μL DMSO溶解，再加入10 μL N-甲基嗎啉，混合均勻，37 ℃反應90 min。②反應完成之后再加入1 mL的DMSO，得到百草枯活化液待用。③取1 mg AP酶溶解在0.1 mol/L Tris，pH為8.0的緩沖液中，加入600 μL百草枯活化液，反應 30 min。④反應完成之后，加入100 μL 1 mol/L甘氨酸，反應15 min。⑤用蛋白測定儀確定蛋白標記物濃度。⑥用酶標記物稀釋液稀釋至25 μg/mL。

圖2 R2生產工藝流程圖

1.3.3 標準液的制備

將百草枯國家標準物（貨號：YJ-XXXX）用 0.1 mol/L PH為7.4的PBS緩沖液溶解成1 mg/mL母液；再分別稀釋成0 ng/mL、5 ng/mL、25 ng/mL、 125 ng/mL、250 ng/mL及500 ng/mL 6個不同濃度的標準液C1～C6。

2 結果與分析

用6個不同濃度標準液對發(fā)光儀進行定標后，分別進行準確性、靈敏度、特異性、精密度以及穩(wěn)定性分析。

2.1 準確度分析

將1 mL高濃度標準液C5（250 ng/mL）加入到9 mL低濃度標準液C1（0 ng/mL）中，混勻后在化學發(fā)光免疫分析儀上測試混合液和低濃度標準液濃度值，各測試3次，計算平均值，回收率應在85%～115%。根據公式（1）計算結果，回收率為99.58%，在要求范圍以內。測試數據見表1。

表1 準確度測試數據

式中：R為回收率，%；V為加入高濃度標準液體積，mL；V0為低濃度標準液的體積，mL；C為混合液測試平均值，ng/mL；C0為低濃度標準液測試值，ng/mL；Cs為已知高濃度標準液濃度，ng/mL。

2.2 靈敏度評估

取標準液C1和C2作為待測樣本，在化學發(fā)光測定儀上對C1進行20次測定，C2測試3次，統(tǒng)計測量結果的發(fā)光值（RLU），計算C1的平均值（M）和標準差（Standard Deviation，SD），得出M-2SD；同時根據C1和C2之間的發(fā)光值（RLU）進行兩點回歸擬合得出一次方程，將M-2SD的RLU值代入上述方程中，求出對應的濃度值，即為產品的靈敏度，要求靈敏度不能大于5 ng/mL（國家標準要求最低殘留量）。從表2數據可以計算得出，試劑檢測靈敏度為0.37 ng/mL，遠遠小于5 ng/mL，產品具有很高的靈敏度。

表2 靈敏度測試數據

2.3 特異性分析

往試劑盒中滴加干擾物并在化學發(fā)光測定儀上分別測定濃度為500 ng/mL的干擾物多菌靈和毒死蜱，各測試3次，測定結果應不得高于0.5 ng/mL。從表3數據可以看出，兩組干擾物的測試結果均遠遠小于0.5 ng/mL，說明試劑盒受干擾物影響很小，具有很高的特異性。

表3 特異性測試數據

2.4 精密度

在化學發(fā)光測定儀上分別測定標準液C2和C5，各重復測試至少10次，分別計算測量值的平均值（x—）和標準差（SD）[6]。計算變異系數（Coefficient of Variation，CV），結果應≤8%。由表4可知，標準液C2和C5變異系數均小于8%，產品的精密度 很高。

表4 精密度測試數據

2.5 穩(wěn)定性評估

將制備好的試劑盒進行37 ℃加速老化7 d后，用化學發(fā)光免疫分析儀測試，對測試結果的發(fā)光值（RLU）進行對照，數據見表。從表5中統(tǒng)計結果可以看出，實驗組的蛋白活性回收率達到了95%以上，說明試劑盒穩(wěn)定性很好。

表5 穩(wěn)定性實驗結果對照表

3 結論

利用磁微粒化學發(fā)光法技術對百草枯6個不同濃度的標準液C1～C6進行檢測，通過準確性、靈敏度、特異性、精密度以及穩(wěn)定性分析，可以得到回收率為99.58%，檢測靈敏度為0.37 ng/mL，精密度≤8%，蛋白活性回收率可達到98.17%。