高效液相色譜-熒光檢測法對動物源性食品中 氟喹諾酮類藥物殘留的檢測

袁 麗，丁 磊，楊 希，丁建蘭，歐陽倩

（1.鷹潭市檢驗檢測認(rèn)證院，江西鷹潭 335000；2.鷹潭市市場監(jiān)督管理執(zhí)法稽查局，江西鷹潭 335000）

氟喹諾酮（Fluoroquinolones，F(xiàn)QS）屬于喹諾酮類，又稱吡啶酮酸類，是一種化學(xué)合成的新型抗菌藥，因其具有抗菌活性強、抗菌譜廣、蛋白結(jié)合率低、高效、低毒、組織穿透力強、半衰期較長、用藥次數(shù)少及價格低廉等特點，被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)和禽畜感染性疾病及臨床上細(xì)菌感染性疾病的防治[1-5]。但由于氟喹諾酮類藥物在動物體內(nèi)代謝周期長以及養(yǎng)殖人員對其的不規(guī)范使用使其在動物源性食品中的殘留超標(biāo)。該藥物殘留通過食物鏈進入人體，嚴(yán)重危害人體健康。因此開展動物源性食品中氟喹諾酮類藥物殘留的檢測。

目前，各縣（或市）級檢驗檢測機構(gòu)用于檢測動物源性食品中的氟喹諾酮類藥物的殘留量的方法主要有高效液色譜相法和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法。本文參照《水產(chǎn)品中諾氟沙星、鹽酸環(huán)丙沙星、恩諾沙星殘留量的測定 液相色譜法》（農(nóng)業(yè)部783號公告-2-2006），通過改變色譜條件、除水劑用量的優(yōu)化，為檢驗檢測機構(gòu)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乙腈（色譜純，默克股份兩合公司）；正己烷（色譜純，默克股份兩合公司）；鹽酸（分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；無水硫酸鈉（分析純，西隴科學(xué)股份有限公司）；磷酸（分析純，西隴科學(xué)股份有限公司）。

標(biāo)準(zhǔn)品：鹽酸沙拉沙星、環(huán)丙沙星、恩諾沙星（由江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與標(biāo)準(zhǔn)研究所提供，100 μg/mL）。

1.2 儀器與設(shè)備

UltiMate3000高效液相色譜儀（配熒光檢測器，賽默飛世爾科技中國有限公司）；BSA822-CW電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器上海有限公司）；XW-80A渦旋振蕩混合器（上海精科實業(yè)有限公司)；HY-4B調(diào)速多用振蕩器（常州郎越儀器制造有限公司）；TG16-WS高速臺式離心機（長沙湘儀離心機儀器有限公司）；RE-5299旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；0.45 μm濾膜。

1.3 試驗方法

參照標(biāo)準(zhǔn)《水產(chǎn)品中諾氟沙星、鹽酸環(huán)丙沙星、恩諾沙星殘留量的測定 液相色譜法》（農(nóng)業(yè)部783號公告—2-2006）。

1.3.1 色譜條件

C18色譜柱（50 mm×46 mm，5 μm）；流動相：0.05 mol/L的磷酸溶液（三乙胺調(diào)pH至2.4）∶乙腈=82∶18（V∶V)；流速：0.8 mL/min；柱溫：40 ℃；進樣量：20 μL；熒光檢測器：激發(fā)波長280 nm，發(fā)射波長450 nm。

1.3.2 樣品處理

（1）提取。準(zhǔn)確稱取樣品5 g于50 mL離心管中，加入酸化乙腈20 mL后迅速渦旋，渦旋2 min，再加入無水硫酸鈉5 g，經(jīng)搖床振蕩20 min，4 000 r/min 離心5 min，取上清液。殘渣中加入酸化乙腈20 mL， 重復(fù)上述操作一次，合并上清液。

（2）凈化與濃縮。將上清液置于分液漏斗中，加入乙腈飽和的正己烷25 mL，振蕩1 min，充分靜置，取下層乙腈層移入雞心瓶，40 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干。用流動相2.0 mL溶解殘渣，經(jīng)0.45 μm微孔膜過濾，濾液經(jīng)高效液相色譜儀測定。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的繪制

分別精密吸取標(biāo)準(zhǔn)品鹽酸沙拉沙星、環(huán)丙沙星、恩諾沙星于10 mL容量瓶中，用流動性逐級稀釋成濃度為5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL和300 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的優(yōu)化

農(nóng)業(yè)部783號公告-2-2006中采用的流動相四丁基溴化銨保存期短且需冷藏保存，本次試驗采用農(nóng)業(yè)部1025號公告-14-2008中的乙腈∶磷酸溶液為流動相，流動相易保存、易配制，且3種氟喹諾酮類化合物的分離效果好、峰形好、響應(yīng)值高，色譜圖見圖1。

圖1 3種氟喹諾酮類化合物標(biāo)準(zhǔn)品在50 ng/mL下的色譜圖

2.2 提取條件的優(yōu)化

無水硫酸鈉是常用的除水劑，農(nóng)業(yè)部783號公告-2-2006中加入30 g的無水硫酸鈉雖然能起到很好的除水作用，但大量的無水硫酸鈉會包裹在被測樣品表面，使得乙腈提取液無法有效提取樣品中的待測物。本試驗過程中比較了無水硫酸鈉不同用量的影響，分別加入3 g、5 g、10 g無水硫酸鈉，試驗結(jié)果表明無水硫酸鈉用量為5 g時，3種氟喹諾酮類化合物的回收率達(dá)到最高。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

以標(biāo)準(zhǔn)工作溶液濃度為橫坐標(biāo)、各化合物色譜峰面積為縱坐標(biāo)繪制曲線，得到3種化合物的標(biāo)準(zhǔn)曲線；以3倍信噪比時對應(yīng)的濃度得到化合物的檢 出限。

從表1可見，3種化合物的線性相關(guān)系數(shù)均大于0.999，表明在5～300 ng/mL濃度范圍內(nèi)3種化合物均呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系；3種化合物的儀器檢出限為0.004～0.010 μg/kg。

2.4 精密度試驗

將濃度為50 ng/mL的鹽酸沙拉沙星、環(huán)丙沙星、恩諾沙星混合標(biāo)準(zhǔn)溶液分別連續(xù)進樣8次，記錄其峰面積，精密度用峰面積變化的RSD表示。如表2所示，鹽酸沙拉沙星、環(huán)丙沙星、恩諾沙星的RSD分別為0.27%、0.29%、0.30%，均小于2%，表明精密度良好。

2.5 加標(biāo)試驗

按試驗方法對空白魚肉、豬肉樣品進行加標(biāo)回收試驗，3種氟喹諾酮類藥物的加標(biāo)量分別為4 μg/kg、40 μg/kg、80 μg/kg，計算回收率和測定值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見表3。魚肉和豬肉中3種氟喹諾酮類藥物的回收率是62.80%～94.45%，回收率均能達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)要求，相對偏差為0.29%～5.30%，精密度 較好。

表3 不同濃度下3種氟喹諾酮類藥物的添加回收率

3 結(jié)論

本試驗以農(nóng)業(yè)部783號公告-2-2006為基準(zhǔn)，對檢測魚肉、豬肉中氟喹諾酮類化合物殘留量的檢測方法進行優(yōu)化，結(jié)果表明魚肉和豬肉中3種氟喹諾酮類藥物的回收率均能達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)要求，能夠為檢測動物源性食品中的氟喹諾酮類藥物的殘留量提供參考。