青光安Ⅱ號方及其有效組分對DBA/2J小鼠視網膜Ras、MEK及ERK蛋白表達的影響

秦惠鈺　曾志成　李銀鑫　彭清華

〔摘要〕 目的 觀察青光安Ⅱ號方及其有效組分對DBA/2J小鼠視網膜細胞中Ras、MEK與ERK蛋白表達的影響，探討其對視神經保護的作用機制。方法 將8只雌性C57BL/6J小鼠作為正常對照組（A組），采用隨機數字表法將48只雌性DBA/2J小鼠分為6組：模型組（B組）、陽性對照組（C組）、青光安Ⅱ號方湯劑組（D組）、青光安Ⅱ號方有效組分低劑量組（E組）、青光安Ⅱ號方有效組分中劑量組（F組）、青光安Ⅱ號方有效組分高劑量組（G組），每組8只。A、B組給予12.91 mL/（kg·d）蒸餾水;C組給予0.31 g/（kg·d）益脈康分散片;D組給予9.67 g/（kg·d）青光安Ⅱ號方湯劑;E、F、G組分別給予0.85、1.70、3.40 g/（kg·d）青光安Ⅱ號方有效組分。每4周進行眼壓測量以及裂隙燈檢查;灌胃4周后取視網膜組織行Western blot檢測各組小鼠視網膜Ras、MEK與ERK蛋白的表達水平。結果 C57BL/6J小鼠不同時相點的眼壓不隨年齡增長而變化（P>0.05）;DBA/2J小鼠眼壓在第18～38周高于C57BL/6J小鼠（P<0.05）。裂隙燈檢查C57BL/6J小鼠眼前段均未見明顯異常;DBA/2J小鼠隨周齡增長逐漸出現角膜鈣化、虹膜基質萎縮、瞳孔后粘連等眼前節病變。與A組比較，B組Ras、MEK、ERK蛋白表達水平均降低（P<0.05）;與B組比較，C、D、E、F、G組Ras蛋白表達水平均升高（P<0.05），G組MEK、ERK蛋白表達水平均升高（P<0.05）;與C組比較，G組Ras蛋白表達水平升高（P<0.05）;與D組比較，G組MEK蛋白表達水平升高（P<0.05）;與E、F組比較，G組Ras蛋白表達水平升高（P<0.05）。結論 青光安Ⅱ號方及其有效組分低、中、高劑量對DBA/2J小鼠視網膜Ras、MEK、ERK蛋白可起到不同程度的上調作用，以青光安Ⅱ號方有效組分高劑量組效果最佳。

〔關鍵詞〕 青光眼;青光安Ⅱ號方;DBA/2J小鼠;視網膜神經節細胞;視神經保護

〔中圖分類號〕285.5? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ? 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2022.05.008

Effect of Qingguang'an Ⅱ Decoction and its effective components on the expression of Ras，

MEK and ERK proteins in retina of DBA/2J mice

QIN Huiyu ZENG Zhicheng LI Yinxin PENG Qinghua

（1. Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China; 2. Department of Ophthalmology， Hubei Hospital of Traditional Chinese Medicine， Wuhan， Hubei 430006， China; 3. The First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410007， China）

〔Abstract〕 Objective To observe the effect of Qingguang'an Ⅱ Decoction and its effective components on the expression of Ras， MEK and ERK proteins in retina of DBA/2J mice， and to explore its mechanism of action on optic nerve protection. Methods 8 female C57BL/6J mice were divided into normal control group （group A）. A total of 48 female DBA/2J mice were divided into 6 groups by random number table method： model group （group B）， positive control group （group C）， Qingguang'an Ⅱ Decoction group （group D）， Qingguang'an Ⅱ Decoction effective component low-dose group （group E）， Qingguang'an Ⅱ Decoction effective component medium-dose group （group F）， Qingguang'an Ⅱ Decoction effective component high-dose group （group G）， with 8 mice in each group. Groups A and B were given 12.91 mL/（kg·d） distilled water; group C was given 0.31 g/（kg·d） Yimaikang dispersible tablets; group D was given 9.67 g/（kg·d） Qingguang'an Ⅱ Decoction; groups E， F and G were given 0.85， 1.70， 3.40 g/（kg·d） Qingguang'an Ⅱ Decoction effective component， respectively. Intraocular pressure measurement and slit lamp examination were performed every 4 weeks. After 4 weeks of intragastric administration， retinal tissues were collected for Western blot to detect the relative expression of Ras， MEK and ERK proteins in the retina of mice in each group. Results The intraocular pressure of C57BL/6J mice at different time points did not change with age （P>0.05）. The intraocular pressure of DBA/2J mice was higher than C57BL/6J mice at 18-38 weeks （P<0.05）. Slit lamp examination showed no abnormal anterior segment of C57BL/6J mice; DBA/2J mice gradually developed corneal calcification， iris matrix atrophy， retropupil adhesion and other anterior segment lesions with age. Compared with group A， the protein expression levels of Ras， MEK and ERK in group B were decreased （P<0.05）; compared with group B， the expression of Ras protein in groups C， D， E， F and G increased （P<0.05）， and the protein expression levels of MEK and ERK in group G increased （P<0.05）; compared with group C， the expression level of Ras protein in group G was increased （P<0.05）; compared with group D， the expression of MEK protein in group G increased （P<0.05）; compared with groups E and F， the expression of Ras protein in group G increased （P<0.05）. Conclusion Qingguang'an Ⅱ Decoction and its effective component at low， medium and high doses could up-regulate Ras， MEK and ERK proteins in retina of DBA/2J mice to different degrees. The effect of the high-dose group of Qingguang'an Ⅱ Decoction is the best.EB65E8DF-5337-45BA-A6FD-4CA01EDF54A7

〔Keywords〕 glaucoma; Qingguang'an Ⅱ Decoction; DBA/2J mice; retinal ganglion cells; optic nerve protection

青光眼視神經病變以視網膜神經節細胞（retinal ganglion cells， RGCs）進行性凋亡為主要病理特征[1]，病理性眼壓增高程度、持續時間與其嚴重程度密切相關，但臨床病例資料顯示，患者術后即使眼壓控制穩定，部分仍出現視神經進行性損傷，即存在RGCs進行性凋亡[2-3]。為了減緩視神經損傷的發展，降低或阻斷RGCs凋亡、提高其存活率逐漸成為主要研究方向[4]。相關研究表明，視網膜中Ras蛋白與ERK蛋白的表達可抑制RGCs凋亡，提高其存活率，從而起到保護神經的作用，絲裂原活化蛋白激酶/細胞外信號調節激酶通路（mitogen-ativated protein kinase/extracellular signal-regulated kinase， MAPK/ERK）是其主要信號通路[5]，而絲裂原活化的細胞外信號調節激酶（mitogen-activated extracellular signal-regulated kinase， MEK）也是此通路上的關鍵蛋白[6]。

中醫學認為青光眼視神經損傷的病機為氣血失和，目中玄府閉塞，神水瘀積，綜合現代血瘀特征，其綜合病理應為血瘀水停[7]。對此，彭清華教授創制了具有滋補肝腎、益氣活血之功效的青光安Ⅱ號方。本實驗通過觀察青光安Ⅱ號方及其有效組分對DBA/2J小鼠視網膜細胞中MAPK/ERK信號通路Ras、MEK與ERK蛋白表達的影響，進一步明確其對視神經保護的作用機制，為青光眼視神經保護作用藥物的研究發展提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1? 實驗動物

健康、無眼部疾患的雌性DBA/2J小鼠50只，SPF級，10周齡，體質量18～22 g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，實驗動物許可證號：SCXK（京）2016-0006;健康、無眼部疾患的雌性C57BL/6J小鼠8只，SPF級，10周齡，體質量18～22 g，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，實驗動物許可證號：SCXK（湘）2016-0002。

本實驗通過湖南中醫藥大學動物實驗倫理委員會批準，審批編號：LL2019100802，實驗動物飼養于湖南中醫藥大學中醫藥防治眼耳鼻咽喉疾病湖南省重點實驗室，實驗動物使用許可證號：SYXK（湘）2019-0009，動物飼養和實驗操作遵循湖南中醫藥大學制定的科研動物和實驗室使用規范。

1.2? 實驗藥品

青光安Ⅱ號方組成：枸杞子、女貞子、牛膝、黃芪、燈盞花、川芎（比例為1.5∶1.5∶1∶1.5∶1∶1），由湖南中醫藥大學第一附屬醫院藥劑科提供;青光安Ⅱ號方有效組分：對青光安Ⅱ號方原材料進行水提取和80%乙醇提取、溶劑分配分離、AB-8大孔吸附樹脂法分離、洗脫，采用UPLC-Q-TOF法[8]從提取物中鑒定出有效組分復合物;益脈康分散片（湖南湘雅制藥有限公司，國藥準字：Z20080073，批號：1903119，規格：0.4 g/片）。

1.3? 主要試劑

RIPA裂解液（批號：G2002）、BCA蛋白定量檢測試劑盒（批號：G2026）、HRP標記山羊抗兔（批號：GB23303）均購自武漢賽維爾生物科技有限公司;兔抗Ras多克隆抗體（批號：BJ08049011）、兔抗ERK多克隆抗體（批號：BO09128315）均購自北京博奧森生物技術有限公司;兔抗MEK多克隆抗體（江蘇親科生物研究中心有限公司，批號：61u0921）;兔抗β-actin多克隆抗體（武漢賽維爾生物科技有限公司，批號：G12001）。

1.4? 主要儀器

Tono-pen筆式眼壓計（美國Reichert公司，型號：AVIA）;裂隙燈顯微鏡（日本Topcon公司，型號：SL-2G）;眼科手術顯微鏡（蘇州六六視覺科技股份有限公司，型號：YZ20T4）;超聲裂解儀（美國SONICS&MATERIALS公司，型號：VCX130）;臺式高速冷凍離心機（香港力康生物醫療科技控股有限公司，型號：Neofuge 13R）;勻漿儀（型號：KZ-Ⅱ）、渦旋混合器（型號：MX-F）、脫色搖床（型號：TSY-B）均購自武漢賽維爾生物科技有限公司;雙垂直電泳儀（型號：DYCZ-24DN）、轉印電泳儀（型號：DYCZ-40D）均購自北京六一生物科技有限公司;PVDF膜0.45 μm（型號：IPVH00010）、PVDF膜0.22 μm（型號：ISEQ00010）均購自美國Millipore公司。

1.5? 動物模型的建立

檢測內容包括眼壓和眼前節的改變。DBA/2J小鼠是一種天然的年齡相關慢性高眼壓模型鼠[9]，隨著月齡增大出現角膜鈣化、虹膜基質萎縮、房角關閉等眼前節病變[10]。每4周對所有進入實驗室經過適應性飼養后的小鼠進行眼壓測量以及裂隙燈檢查，將38周齡眼壓值超過20 mmHg（眼壓異常高值小鼠不納入實驗分組）、至少有一眼出現明顯角膜鈣化斑、虹膜萎縮、瞳孔變形的DBA/2J小鼠視為模型建立成功[11]，最終納入48只DBA/2J小鼠。

1.6? 分組及給藥

8只C57BL/6J小鼠為正常對照組（A組）;按照隨機數字表法將48只DBA/2J小鼠平均分為模型組（B組）、陽性對照組（C組）、青光安Ⅱ號方湯劑組（D組）、青光安Ⅱ號方有效組分低劑量組（E組）、青光安Ⅱ號方有效組分中劑量組（F組）、青光安Ⅱ號方有效組分高劑量組（G組），共7組。參照《中醫科研設計與統計學》[12]，將小鼠體質量（各體質量差異小，取均值28 g）與成人體質量60 kg進行等效藥物劑量換算，以蒸餾水為溶劑進行配制（混懸液給藥前需搖勻），連續4周給小鼠灌胃。劑量如下：A、B組：12.91 mL/（kg·d）蒸餾水;C組：益脈康分散片0.31 g/（kg·d）;D組：青光安Ⅱ號方湯劑9.67 g/（kg·d）;E、F、G組：青光安Ⅱ號方有效組分0.85、1.70、3.40 g/（kg·d）（相當于成人一日等效劑量的0.5倍、1倍、2倍）。EB65E8DF-5337-45BA-A6FD-4CA01EDF54A7

1.7? 動物取材

灌胃4周后對所有實驗小鼠行頸椎脫臼處死。剜出小鼠眼球，沿角鞏膜緣剪開，除去角膜、虹膜、晶狀體剝離出視網膜組織置入EP管，標記后保存于液氮罐中。各組小鼠右眼視網膜組織用于Western blot檢測Ras、MEK、ERK蛋白。

1.8? Western blot檢測視網膜Ras、MEK及ERK蛋白表達水平

對樣本進行組織勻漿，4 ℃、12 000 r/min離心5 min，離心半徑10 cm，上清即為總蛋白溶液，用BCA測定法測定蛋白濃度，進行SDS-PAGE電泳、轉膜、染色與封閉，孵育一抗（兔抗Ras、兔抗MEK、兔抗ERK多克隆抗體，均按照1∶1000稀釋），再孵育二抗，滴加ECL發光工作液與PVDF膜上孵育后顯色，再以β-actin蛋白作為內參，采用AlphaEaseFC灰度分析軟件對蛋白電泳條帶進行灰度值分析，得出蛋白表達量。

1.9? 統計學方法

采用SPSS 22.0統計軟件對實驗結果進行分析，計量資料以“x±s”表示，先進行正態性及方差齊性檢驗，若滿足正態性和方差齊性，多組比較采用單因素方差分析;不滿足方差齊性時，則用秩和檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1? 兩類小鼠眼壓變化結果

第10～38周齡的8只C57BL/6J小鼠雙眼眼壓波動范圍在11～16 mmHg;48只DBA/2J小鼠雙眼眼壓從第10周開始逐漸上升，第18周開始明顯上升。

C57BL/6J小鼠不同時相點的眼壓不隨年齡增長而變化（P>0.05）;將C57BL/6J小鼠和DBA/2J小鼠同一時相點眼壓比較，發現DBA/2J小鼠眼壓第18～38周均高于C57BL/6J小鼠（P<0.05）。詳見表1。

2.2? 裂隙燈檢查情況

第10～38周齡的C57BL/6J小鼠角膜透明，虹膜紋理清晰，瞳孔居中而圓，眼前段均未見明顯異常;DBA/2J小鼠在第10周齡出現邊界不清的角膜鈣化斑，第18周齡時可見清晰成片的角膜鈣化斑;第22、26周可觀察到逐漸加重的角膜鈣化斑，多數在第30周齡可見密集的角膜鈣化斑，局部出現虹膜基質萎縮，瞳孔后粘連;第38周齡虹膜明顯萎縮，瞳孔不規則。各眼前節情況見圖1。

2.3? 各組Ras、MEK及ERK蛋白表達水平比較

與A組比較，B組Ras、MEK、ERK蛋白表達水平均降低（P<0.05）;與B組比較，C、D、E、F、G組Ras蛋白表達水平均升高（P<0.05），G組MEK、ERK蛋白表達水平均升高（P<0.05）;與C組比較，G組Ras蛋白表達水平升高（P<0.05）;與D組比較，G組MEK蛋白表達水平升高（P<0.05）;與E、F組比較，G組Ras蛋白表達水平升高（P<0.05）。詳見圖2、表2。

3 討論

青光眼作為世界首位不可逆性致盲眼病，40歲以上高眼壓癥人群達3%～10%，若不進行干預，將有10%以上在5～10年內發展為青光眼[13]。與此同時，青光眼RGCs凋亡相關信號通路的研究逐漸成為熱點，真核細胞中存在廣泛的絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases， MAPKs），而參與細胞內重要信號傳導的MAPK信號通路，在細胞的生長、增殖、分化、凋亡等過程中起著重要作用[14]，其主要途徑Ras-Raf-MEK-ERK符合經典的三步酶促級聯反應：細胞外各刺激物結合受體后，上游激活蛋白Ras釋放二磷酸鳥苷，同時結合三磷酸鳥苷活化，通過激活MAPK激酶Raf后將其從胞質轉移至胞膜，C端催化區域再與MEK結合，被激活的雙重特異性激酶MEK能使ERK的蘇氨酸和絡氨酸雙位點磷酸化，激活ERK移位進入細胞核內造成多種轉錄因子磷酸化，促進一系列基因表達和抗凋亡作用產生[15]。相關實驗研究顯示，MAPK/ERK信號通路能抑制炎癥因子，促進小膠質細胞活化，從而起到保護視神經的作用，提高了RGCs存活率，是重要的抑制細胞凋亡的經典通路[16]。

近年來，中醫藥在青光眼視神經保護方面取得了一定成績，彭清華教授創制的青光安Ⅱ號方以枸杞子、女貞子為君藥，枸杞子補腎益精、養肝明目，枸杞多糖上調大鼠模型中具有神經保護作用的HSP70和神經肽mRNA的表達，改善神經退行性病變[17];女貞子補益肝腎、明目，能夠調節細胞凋亡的調控因子，保護神經細胞[18]。以牛膝、黃芪為臣藥，牛膝補肝腎、活血化瘀，性善下行，利水通淋，可用于非動脈炎性前部缺血性視神經病變[19];黃芪益氣固表，黃芪注射液能上調大鼠視網膜組織NGF、TrKA蛋白表達以及抑制p75NTR mRNA及JNK蛋白，促進NF-κB蛋白表達，對視神經牽拉傷大鼠RGCs具有保護作用[20-21]。以燈盞花、川芎為佐藥，燈盞花活血化瘀通絡，其有效成分野黃芩苷、咖啡酸、東莨菪內酯等可促進體外RGCs存活[22];川芎活血行氣、祛風止痛，其主要成分川芎嗪具有改善微循環、抗炎和抑制細胞凋亡作用[23]，能改變RGC-5細胞內抗氧化酶表達，起到對氧化損傷的RGCs的保護作用[24]。另有實驗表明，川芎嗪注射液可能通過升高視網膜Bcl-2蛋白表達水平、降低Bax蛋白表達水平、改變Bcl-2/Bax比值，從而減少RGCs凋亡[25]。諸藥相合，共奏滋補肝腎、益氣活血之效，能有效改善局部微循環從而保護視神經。

本實驗通過對DBA/2J小鼠各周齡進行眼壓以及眼前節裂隙燈檢查，驗證了DBA/2J小鼠是慢性高眼壓的理想模型。從第38周齡開始用青光安Ⅱ號方及其有效組分、益脈康分散片進行為期4周的灌胃干預，實驗結果表明：成模后的DBA/2J小鼠視網膜中Ras、MEK、ERK蛋白表達水平降低，說明MAPK/ERK信號傳導通路被抑制，而青光安Ⅱ號方及其有效組分低、中、高劑量對DBA/2J小鼠視網膜Ras、MEK、ERK蛋白起到一定程度的上調作用，以青光安Ⅱ號方有效組分高劑量組效果最佳。從理論角度分析，青光安Ⅱ號方及其有效組分是通過激活視網膜MAPK/ERK信號通路，上調通路相關蛋白表達，從而達到抑制RGCs凋亡保護視神經的作用，青光安Ⅱ號方是一種價廉、安全的青光眼視神經保護藥物，有望投入臨床治療中。EB65E8DF-5337-45BA-A6FD-4CA01EDF54A7

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（本文編輯? 周? 旦）EB65E8DF-5337-45BA-A6FD-4CA01EDF54A7