桃紅四物湯對ANFH模型大鼠Notch1受體蛋白表達的影響

姚金龍　馮海波　李益亮　葉心雨　孫紹裘　劉曉嵐

〔摘要〕 目的 觀察桃紅四物湯對創(chuàng)傷性股骨頭缺血性壞死（avascular necrosis of femoral head， ANFH）模型大鼠Notch1受體蛋白表達的影響。方法 從60只SD實驗大鼠中隨機挑選12只為假手術組，其余大鼠參照Norman方法進行造模構建ANFH模型，然后隨機均分為桃紅四物湯高劑量組、桃紅四物湯中劑量組、桃紅四物湯低劑量組、模型組，每組12只，對于假手術組，采用同樣的術式顯露髖關節(jié)，但是不進行造模而是直接縫合。待大鼠造模成功后，給予桃紅四物湯高、中、低劑量組等量的高、中、低劑量桃紅四物湯進行灌胃，模型組與假手術組分別予以等量的生理鹽水進行灌胃。灌胃8周后處死各組大鼠，切取股骨頭，采用Micro-CT觀察各組大鼠股骨頭形態(tài)變化，光鏡下計算出股骨頭平均空骨陷窩率，采用免疫組織化學法檢測Notch1受體蛋白的表達水平。結果 通過Micro-CT觀察，桃紅四物湯各組較模型組股骨頭軟骨面損傷情況好，并且隨著藥物濃度的增加，桃紅四物湯中、高劑量組較桃紅四物湯低劑量組股骨頭塌陷情況好。光學顯微鏡下觀測，桃紅四物湯各組大鼠平均空骨陷窩率均低于模型組（P<0.05或P<0.01），高于假手術組（P<0.05或P<0.01），而Notch1受體蛋白表達高于模型組和假手術組（P<0.05或P<0.01）;桃紅四物湯低劑量組大鼠平均空骨陷窩率高于桃紅四物湯高、中劑量組（P<0.05），而Notch1受體蛋白表達低于桃紅四物湯中、高劑量組（P<0.05）。桃紅四物湯高、中劑量組大鼠平均空骨陷窩率以及Notch1受體蛋白表達比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。結論 桃紅四物湯能降低ANFH大鼠空骨陷窩率，治療ANFH，并且該過程可能與桃紅四物湯促進Notch1受體蛋白的表達有關。

〔關鍵詞〕 桃紅四物湯;股骨頭缺血性壞死;大鼠;空骨陷窩率;Notch1受體

〔中圖分類號〕R274.9? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ? 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2022.05.003

Effect of Taohong Siwu Decoction on the expression of Notch1 receptor protein in ANFH

model rats： Study on the academic thoughts and clinical experience of famous

orthopaedic teacher Sun Dawu （3）

YAO Jinlong FENG Haibo LI Yiliang YE Xinyu SUN Shaoqiu LIU Xiaolan

（1. The Second Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410005， China;

2. Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China）

〔Abstract〕 Objective To observe the effect of Taohong Siwu Decoction on the expression of Notch1 receptor protein in rats with avascular necrosis of femoral head （ANFH）. Methods 12 SD rats were randomly selected from 60 SD rats as the sham operation group， and the other rats were modeled by Norman method to construct ANFH model， and then randomly divided into Taohong Siwu Decoction high-dose group， Taohong Siwu Decoction medium-dose group， Taohong Siwu Decoction low-dose group and model group， with 12 rats in each group. For the sham operation group， the hip joint was exposed using the same operation， but the hip joint was directly sutured without modeling. After successful modeling， the rats were given Taohong Siwu Decoction high-dose， medium-dose and low-dose groups of equal amount of high， medium and low dose Taohong Siwu Decoction for intragastric administration， model group and sham operation group were given equal amount of normal saline intragastric administration. After 8 weeks of intragastric administration， the rats in each group were sacrificed， and the femoral head was cut. Micro-CT was used to observe the morphological changes of the femoral head in each group， the average rate of hollow lacunae of the femoral head was calculated under light microscope， and the expression of Notch1 receptor protein was detected by immunohistochemistry. Results By Micro-CT observation， the femoral head cartilage damage was better in each group of Taohong Siwu Decoction than in model group， and with the increase of concentration， the femoral head collapse was better in Taohong Siwu Decoction medium-dose and high-dose groups than in Taohong Siwu Decoction low-dose group. Under a light microscope， the average rate of hollow lacunae of each group of Taohong Siwu Decoction was lower than that of model group （P<0.05 or P<0.01）， and higher than that of sham operation group （P<0.05 or P<0.01）， and the expression of Notch1 receptor protein was higher than that of model group and sham operation group （P<0.05 or P<0.01）. The average rate of hollow lacunae in Taohong Siwu Decoction low-dose group was higher than that in Taohong Siwu Decoction high-dose and medium-dose groups （P<0.05）， and the expression of Notch1 receptor protein was lower than that in Taohong Siwu Decoction medium-dose and high-dose groups （P<0.05）. There were no significant differences in the average rate of hollow lacunae and Notch1 receptor protein expression between Taohong Siwu Decoction high-dose and medium-dose groups （P>0.05）. Conclusion Taohong Siwu Decoction can reduce the rate of hollow lacunae in ANFH rats and treat ANFH， and this process may be related to Taohong Siwu Decoction promoting the expression of Notch1 receptor protein.

〔Keywords〕 Taohong Siwu Decoction; avascular necrosis of femoral head; rats; rate of hollow lacunae; Notch1 receptor

創(chuàng)傷性股骨頭缺血性壞死（avascular necrosis of femoral head， ANFH）是指創(chuàng)傷所引起的股骨頭血液循環(huán)的障礙，骨細胞、軟骨細胞因缺血缺氧而導致裂解死亡，因而造成患者髖關節(jié)活動障礙，甚至跛行的疾病[1]。流行病學調查結果顯示，近年來隨著交通的發(fā)展，高能量損傷發(fā)生越來越頻繁，ANFH的發(fā)病率也逐年上升[2]。髖關節(jié)脫位及其周圍骨折，使得患者5年內出現不同程度的ANFH，發(fā)病率已經上升至50%[3]。ANFH致殘率高并且并發(fā)癥多，因此，往往會給患者及其家庭帶來災難性的后果[4]。而且，隨著高能量損傷的年輕化，后期二次手術甚至多次手術進行髖關節(jié)翻修的可能性大，因此，保髖治療成為了年輕ANFH患者的首選方式[5]。多項研究表明[6-7]，保髖治療的關鍵在于改善股骨頭周圍的血運。近年來，中醫(yī)藥對于改善股骨頭周圍血運，促進骨質新生的效果顯著，受到了越來越多的關注。國家級名中醫(yī)孫達武臨床常用桃花四物湯治療ANFH，本研究團隊的前期研究表明，桃紅四物湯在改善股骨頭周圍的血運，促進血管新生中有著特有的優(yōu)勢[8-9]。研究證實，Notch1信號通路在生物進化過程中是一條高度保守的信號通路，它與血管內皮細胞生長、增殖、遷徙、分化以及死亡都密切相關[10]。本實驗通過對ANFH模型大鼠施以桃紅四物湯以后，觀察血清中Notch1受體蛋白表達情況以及股骨頭形態(tài)的變化，探討桃紅四物湯防治ANFH的具體作用機制。

1 材料與方法

1.1? 實驗動物

實驗動物為湖南中醫(yī)藥大學醫(yī)學動物實驗研究中心統(tǒng)一購買的SPF級SD大鼠，實驗動物許可證號為SCXK（湘）2017-0003，實驗動物倫理編號為LL2019100906，動物為6月齡SD大鼠，體質量250～300 g，雌雄各30只，動物實驗中切實遵循動物實驗倫理章程，并且在遵守實驗室相關規(guī)章制度下進行實驗，普通飼料飼養(yǎng)，飲水自由，實驗室溫控在20～25 ℃，濕度保持在50%～70%，每日光照時長為12 h。

1.2? 實驗試劑

桃紅四物湯參照吳謙《醫(yī)宗金鑒》書中所記載的藥物配伍劑量：桃仁20 g，紅花10 g，生地黃20 g，赤芍20 g，當歸20 g，川芎10 g。所有藥材均為湖南中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院藥劑科購買、煎煮、制成湯劑。水合氯醛（批號：19XS09R23，100 mL/瓶，福州文萊生物科技有限公司），青霉素鈉注射液（批號：150062659，產品規(guī)格：400萬U×50瓶/盒，山東圣旺藥業(yè)股份有限公司）。

1.3? 主要儀器

光學顯微鏡（型號：PH50，深圳市西派客光學顯微鏡有限公司）;顯微鏡數碼成像系統(tǒng)（型號：DM900，北京萊博公司）;超微量分光光度計（上海鼎科科學儀器有限公司）;生物組織切片機（型號：JK-TBP-3AB，上海精密儀器儀表有限公司）;手動輪轉式石蠟切片機（型號：CUT4062，德國LABSTAR公司）;Micro-CT（型號：Quantum GX，美國PerkinElmer公司）。

1.4? 分組與造模

60只SD實驗大鼠中隨機挑選出12只，為假手術組，其余大鼠參照Norman方法[11]進行造模構建ANFH模型。術前對大鼠禁食、水6 h，先按照1%戊巴比妥鈉 0.02 mL/100 g對大鼠進行腹腔麻醉。麻醉滿意后，將大鼠俯臥位固定于手術臺上，采用背側入路沿著大轉子上下切開2 cm切口，逐層暴露淺筋膜、臀中肌、股骨頭圓韌帶。切斷股骨頭圓韌帶，脫出髖關節(jié)，暴露股骨頭，破壞股骨頭周圍血運，最后沖洗，逐層縫合傷口。然后將大鼠隨機均分為桃紅四物湯高/中/低劑量組、模型組以及假手術組，每組12只，對于假手術組，采用同樣的術式顯露髖關節(jié)，但是不剪斷股骨頭圓韌帶，不破壞股骨頭周圍血運，直接縫合。待大鼠造模成功后，給予桃紅四物湯高、中、低劑量組等量的高、中、低劑量桃紅四物湯灌胃，模型組與假手術組分別予以等量的生理鹽水進行灌胃。術后3 d內每天給予大鼠肌內注射青霉素5萬U預防感染。大鼠造模后，灌胃過程中桃紅四物湯低劑量組、桃紅四物湯中劑量組、模型組脫落死亡大鼠1只，桃紅四物湯高劑量組脫落死亡大鼠2只。大鼠行為上出現跛行，大體上出現股骨關節(jié)面塌陷，Micro-CT出現輪廓清晰的壞死灶，軟骨下骨折則提示造模成功[12]。

1.5? 干預方法

造模后4周，首先從每組大鼠隨機選取2只，切取術側股骨頭，從大體上并且結合Micro-CT觀察造模是否成功。確保造模成功后，每只大鼠每日兩次（分別為9：00點和16：00點）灌胃，灌胃8周。藥物具體劑量參照實驗動物與人體表面積計算方法進行計算[13]：（1）桃紅四物湯低劑量組每日給予桃紅四物湯9 g/kg進行灌胃;（2）桃紅四物湯中劑量組每日給予桃紅四物湯18 g/kg進行灌胃;（3）桃紅四物湯高劑量組每日給予桃紅四物湯36 g/kg進行灌胃;（4）模型組每日給予等量生理鹽水灌胃;（5）假手術組每日給予等量生理鹽水灌胃。

1.6? 觀察指標及檢測方法

1.6.1? 股骨頭Micro-CT檢查? 大鼠麻醉后處死，切取術側股骨頭標本行Micro-CT檢查，觀察股骨頭形狀、大小以及關節(jié)軟骨表面情況。X線掃描參數：電壓90 kV，電流 88 μA，體素尺寸72 μm，曝光時間 14 min，高分辨率掃描模式。

1.6.2? 大鼠股骨頭標本Notch1受體蛋白表達測定

取出大鼠股骨頭標本后，采用免疫組織化學法行樣品制備、抗原修復、背景封閉等步驟測定Notch1受體蛋白的平均光密度。具體步驟：切片后予以石蠟保存，然后經過脫蠟、磷酸鹽緩釋液以及蒸餾水漂洗后，進行孵育。最后對股骨頭成骨細胞用蘇木精-伊紅進行染色，凝膠封存。

1.6.3? 大鼠股骨頭標本空骨陷窩率測定? 對于股骨頭余下標本，先用甲醛固定后再應用5%的硝酸進行脫鈣處理，隨后進行漂洗、包埋、切片，染色后置于高倍鏡下觀察股骨頭空骨陷窩情況，然后進行記錄、統(tǒng)計分析。給予每1張標本進行5次切片處理，然后隨機從每張切片選取50個骨陷窩中讀取空骨陷窩數。

空骨陷窩率=（空骨陷窩平均數/50）×100%[14]。

1.7? 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件對數據進行處理。當數據滿足正態(tài)性、方差齊性時，組間比較采用單因素方差分析，多重比較采用LSD法;當方差不齊時，采用Dunnett’s T3檢驗;當數據不滿足正態(tài)性，采用秩和檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1? 影像學Micro-CT檢查

通過藥物干預后發(fā)現：ANFH模型大鼠灌胃8周后，可見模型組骨小梁紊亂，可見普遍斷裂，骨質較少，股骨頭塌陷明顯;桃紅四物湯組相對模型組而言骨質有所改善，骨小梁有局部性修復，骨小梁和骨性結構有明顯改善;假手術組骨小梁排列整齊、有序，骨質緊密，股骨頭光滑無塌陷;桃紅四物湯高、中劑量組較桃紅四物湯低劑量組骨質修復更為明顯。詳見圖1-5。

2.2? 各組大鼠Notch1受體平均光密度比較

灌胃8周后，桃紅四物湯高、中、低劑量組Notch1受體表達均明顯高于假手術組和模型組（P<0.05或P<0.01）;桃紅四物物湯高、中劑量組Notch1受體表達均明顯高于桃紅四物湯低劑量組（P<0.05）;假手術組大鼠Notch1受體表達與模型組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）;桃紅四物湯高、中劑量組大鼠Notch1受體表達比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。詳見表1、圖6。

2.3? 各組大鼠空骨陷窩率比較

干預后，桃紅四物湯高、中、低劑量組、假手術組空骨陷窩率均明顯低于模型組（P<0.05或P<0.01）;桃紅四物湯高、中、低劑量組空骨陷窩率明顯高于假手術組（P<0.05或P<0.01）;桃紅四物湯高、中劑量組空骨陷窩率均明顯低于桃紅四物湯低劑量組（P<0.05）;桃紅四物湯高、中劑量組空骨陷窩率比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。詳見表2。

3 討論

ANFH是臨床上十分常見的疾病，導致的主要原因是由于受到巨大的暴力后所引起的股骨頭局部的血運破壞，如髖關節(jié)脫位、股骨頸骨折等[15]。旋股內側動靜脈發(fā)出的上支持帶血管是股骨頭血液供應的主要來源，它供應股骨頭下內側2/3的血運。股骨頭的血液還有旋股外側動靜脈、頭凹動靜脈、滋養(yǎng)血管等，但是血管之間側枝循環(huán)匱乏，彼此交通聯(lián)系少，因此，當一支血管損傷時往往難以依靠其他血管代償來完成股骨頭的血液供應，特別是當旋股內側動靜脈損傷時，股骨頭極易因為缺少血液供應，而發(fā)生骨壞死[16]。因此，改善股骨血運往往就成為了保髖治療ANFH的關鍵。

ANFH主要出現的臨床癥狀有髖關節(jié)疼痛、患肢跛行、活動障礙等，屬于中醫(yī)學“骨痹”“骨痿”“骨蝕”等范疇。中醫(yī)學認為，氣血是骨的重要營養(yǎng)來源，而外傷導致傷筋斷骨破壞人體氣機，損傷人體血脈，血溢脈外，“離經之血便是瘀”，瘀血又作為病理產物，導致氣滯血瘀，筋骨失去濡養(yǎng)而出現壞死。《素問·宣明五氣》云：“血氣不和，則變生百病。”中醫(yī)學治療骨痹早期以活血化瘀為主。桃紅四物湯作為活血化瘀的經典方劑，歷來被認為是治療骨痹的代表方，被廣泛用于臨床上氣滯血瘀型疾病的治療[17-18]。本課題組前期已經證明，桃紅四物湯能夠改善ANFH患者髖關節(jié)功能[8]。高曦等[19]運用桃紅四物湯配合手術治療老年股骨頸骨折，結果發(fā)現能夠縮短患者下床時間，降低患者血液的高凝狀態(tài)，降低深靜脈血栓的發(fā)生率，促進患者康復。

Notch1受體是Notch信號通路之中的一個重要受體蛋白。Notch信號通路包括受體蛋白與配體蛋白，配體與受體之間的信號傳遞，調控著成骨細胞和破骨細胞增殖以及分化，因而可以調節(jié)控制骨重建的進程[20-21]。研究證實，Notch1信號蛋白與血管的生成密切相關[22]。劉振陽等[23]證實，Notch1和血管內皮生長因子可能在皮膚黑色素瘤血管生成中具有協(xié)同作用，能夠促進血管新生。本課題組前期研究證實，Notch1受體在兔皮片移植模型中能夠促進血管新生[24]。空骨陷窩率的升高，是早期股骨頭壞死的典型征象[25]。股骨頭壞死后成骨細胞較少，破骨細胞增多，微觀上表現為骨小梁稀松，結構紊亂甚至斷裂，股骨頭下骨小梁萎縮、稀疏、斷離，因而空骨陷窩數增多[14]。本實驗結果顯示：通過Micro-CT觀察，桃紅四物湯各組較模型組股骨頭軟骨面損傷情況好，并且隨著濃度的增加，桃紅四物湯中、高劑量組較桃紅四物湯低劑量組股骨頭塌陷情況好。而光學顯微鏡下觀測，桃紅四物湯各組大鼠空骨陷窩率均低于模型組（P<0.05或P<0.01），且高于假手術組（P<0.05或P<0.01），而Notch1受體蛋白表達高于模型組和假手術組（P<0.05或P<0.01）;并且隨著濃度的增加，桃紅四物湯低劑量組大鼠空骨陷窩率高于桃紅四物湯高、中劑量組（P<0.05），而Notch1受體蛋白表達低于桃紅四物湯中、高劑量組（P<0.05）。但是，桃紅四物湯高、中劑量組大鼠空骨陷窩率以及Notch1受體蛋白表達并無明顯差異（P>0.05）。

綜上所述，桃紅四物湯可能通過增加Notch1受體表達，促進股骨頭血管新生，從而減少ANFH大鼠的股骨頭空骨陷窩率，促進ANFH大鼠股骨頭骨質的新生，但是不會隨著桃紅四物湯濃度的增加，其促進血管新生、促進骨質新生的能力一直增加，桃紅四物湯具有促進骨質新生的最佳濃度，由于本課題實驗組別數量設置有限，還未有詳細探明，有待近一步開展實驗研究。

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（未完待續(xù)）

（本文編輯? 賀慧娥）