鮮牛奶中抗生素殘留的原因及常用檢測方法

張麗茹 黃新紅 張東麗 李治玲 謝春勝

摘要：抗生素是一種高效的獸藥，在奶牛養(yǎng)殖業(yè)中經(jīng)常用于治療乳房炎等疾病，但如果使用不當(dāng)就會(huì)導(dǎo)致牛奶中殘留過多。鮮牛奶中殘留抗生素可能會(huì)引起多種不良反應(yīng)，其會(huì)造成對(duì)抗生素類藥物的敏感性降低，提高病原菌的耐藥性?，F(xiàn)主要概述鮮牛奶中抗生素殘留的原因以及常用檢測方法，給大家提供一定參考。

關(guān)鍵詞：鮮牛奶；抗生素殘留；原因分析；氯化三苯基四氮唑法；免疫受體試驗(yàn)方法

中圖分類號(hào)：S858

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B

文章編號(hào)：2095-9737（2018）01-0109-01

1 原因分析

新陳代謝和藥物代謝動(dòng)力學(xué)。藥物能夠經(jīng)由不同的被動(dòng)或者主動(dòng)的化學(xué)過程而轉(zhuǎn)運(yùn)到動(dòng)物體內(nèi)，在機(jī)體新陳代謝過程中，部分藥物能夠表現(xiàn)出治療學(xué)或者產(chǎn)生毒性影響，但其他的卻沒有。只要開始藥物治療，在其通過不同途徑代謝結(jié)束前，會(huì)持續(xù)向組織間隔擴(kuò)散。因此抗生素采取一般給藥途徑都會(huì)經(jīng)由不同途徑在一定程度上被消除，如奶液、糞便、尿液以及唾液（反芻動(dòng)物中多次被利用的胃液）。另外，藥物的制劑形式在很大程度上影響奶牛體內(nèi)分子的排出，如某些“長期效應(yīng)”藥物能夠在很長一段時(shí)間保留在注射部位和器官處，同時(shí)也會(huì)長時(shí)間對(duì)微生物有效。

哺乳期乳房處理及殘留物的持續(xù)。奶牛哺乳期發(fā)生乳房炎后主要通過兩種不同的處理機(jī)制進(jìn)行治療，即物理機(jī)制，是指每次擠奶中機(jī)械的排除；生物機(jī)制，即經(jīng)由空隙進(jìn)入血液中。少數(shù)抗生素本身就具有非常高的擴(kuò)散性，能夠快速越過如細(xì)胞壁、血管壁等不同的物理障礙，從而進(jìn)入血液循環(huán)，再通過新陳代謝以不同的渠道消除掉，但其還能夠在乳腺組織中積聚，并在葡萄腺、乳房池以及乳頭內(nèi)存留，就會(huì)在擠奶時(shí)經(jīng)由奶液排到體外。通常情況下，牛奶中殘留的抗生素濃度需要2～5天才會(huì)降低到MRL水平。

干乳期乳房處理。奶牛干乳期需要采取非常特殊的處理方式，這是由于該階段機(jī)體停止產(chǎn)奶，而在最初哺乳期的生理恢復(fù)過程中，藥物制劑的形式以及自身特性都會(huì)明顯影響干乳期處理。在不擠奶的情況下，有時(shí)奶牛治療后在乳頭中殘留的抗生素可能持續(xù)2個(gè)月之久，最終在第一次擠奶時(shí)就會(huì)經(jīng)由初乳排出。

2 常用檢測方法

氯化三苯基四氮唑法。即TTC法，在我國作為檢測鮮牛奶中抗生素殘留的標(biāo)準(zhǔn)方法，其測定原理是在鮮牛奶中加入菌種（嗜熱鏈球菌），經(jīng)培養(yǎng)后再加入無色的TTC指示劑，觀察顏色變化。當(dāng)鮮牛奶中存在抗生素時(shí)，加入菌種后無法增殖，此時(shí)就不會(huì)促使TTC指示劑發(fā)生還原反應(yīng)，從而依舊呈無色狀態(tài)；當(dāng)鮮牛奶中存在抗生素時(shí)，加入菌種后就會(huì)大量生長繁殖，由于其在新陳代謝過程中會(huì)生成大量的氫，導(dǎo)致TTC指示劑發(fā)生還原反應(yīng)而生成還原型的TTC，此時(shí)指示劑變成紅色，從而造成樣品也被染成紅色。也就是說，鮮牛奶顏色沒有變化判為陽性，染成紅色判為陰性。操作時(shí)，先活化菌種，即用接種環(huán)取嗜熱鏈球菌菌種在9 mL滅菌脫脂乳中接種，放在36℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行12～15 h培養(yǎng)，之后保存在2～5℃冰箱中備用。注意每15天進(jìn)行1次轉(zhuǎn)種。第二步是測試菌液，即將上述被活化的嗜熱鏈球菌菌種在滅菌脫脂乳中接種，在36℃添加下進(jìn)行15 h培養(yǎng)，接著添加相同體積的滅菌脫脂乳，充分混勻即制成稀釋的測試菌液。第三步是樣品培養(yǎng)，即取9 mL樣品裝入18 mm×180 mm的試管內(nèi)，注意每份樣品還需要另外設(shè)置一份平行樣。同時(shí)，還要再各做l份陽性和陰性對(duì)照，其中陰性對(duì)照管添加滅菌脫脂乳9 mL，陽性對(duì)照管添加青霉素G參照溶液9 mL。全部試管放在80℃水浴箱中進(jìn)行5 min加熱，經(jīng)過冷卻低于37℃時(shí)再添加1 mL測試菌液，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)試管充分混勻。之后放在36℃水浴箱中進(jìn)行2h培養(yǎng)，接著添加3 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的TTC水溶液，使用渦旋混勻器進(jìn)行15 s混合均勻或者振動(dòng)試管混勻。最后再放在36℃水浴箱內(nèi)進(jìn)行30 min培養(yǎng)，注意避光，即可觀察顏色變化。若樣品顏色沒有發(fā)生變化，可繼續(xù)在水浴中進(jìn)行30 min的避光培養(yǎng)，然后用于最終觀察。觀察時(shí)要確保迅速，如果長時(shí)間避光就會(huì)造成干擾。

免疫受體試驗(yàn)方法。免疫受體檢測法是ELISA（酶聯(lián)免疫分析法）的一種變換形式，其基本原理是以特定抗生素類群（如β-內(nèi)酞胺類）作為靶子，讓某些部位上固定的廣譜受體（如微生物細(xì)胞）或者特定抗體捕捉。大部分檢測法都是根據(jù)競爭性原理，使樣品內(nèi)所含的抗生素與內(nèi)置抗生素標(biāo)志物相互競爭結(jié)合于廣譜受體或者固定抗體，之后采取沖洗和顯色處理。內(nèi)置抗生素標(biāo)志物同廣譜受體或者固定抗體相互結(jié)合會(huì)形成的一種復(fù)合體，在酶的作用下發(fā)生分解，從而生成發(fā)光物質(zhì)或者有色物質(zhì)。鮮牛奶中殘留的抗生素同廣譜受體或者固定抗體結(jié)合后也會(huì)形成復(fù)合體，但在酶的作用下分解不能夠生成發(fā)光物質(zhì)或者有色物質(zhì)。因此通過對(duì)光度或者色度進(jìn)行測定，同時(shí)與參比物進(jìn)行對(duì)照，由此判斷結(jié)果呈陽性還是陰性。由于該法根據(jù)競爭性原理，如果最終的反應(yīng)結(jié)果光度越強(qiáng)或者顏色越深就判斷為陰性，反之就判斷為陽性。這種檢測方法的優(yōu)點(diǎn)是速度快，一般在10 min內(nèi)就能夠得到結(jié)果，但通常只能夠作為定性試驗(yàn)，具有很強(qiáng)的特異性，且檢測費(fèi)用相對(duì)較高。