不均一性核糖核蛋白F抑制流感病毒復(fù)制機(jī)理探究

馬慧玲 任俊錚 趙夢(mèng)嬌 姜波 薛瑞雪 王敏 汪洋 陳靜

摘要：流感病毒在宿主細(xì)胞核內(nèi)復(fù)制時(shí)會(huì)存在大量的病毒RNA，在這個(gè)過(guò)程中細(xì)胞核內(nèi)會(huì)存在相關(guān)的蛋白來(lái)參與流感病毒復(fù)制。為了探討不均一性核糖蛋白F（hnRNP）抑制流感病毒復(fù)制的機(jī)理，研究在細(xì)胞內(nèi)過(guò)表達(dá)hnRNP F蛋白，結(jié)果出現(xiàn)流感病毒復(fù)制被抑制的現(xiàn)象，免疫共沉淀和間接免疫熒光試驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了hnRNP F通過(guò)與流感病毒RNA結(jié)合抑制核酸出核，發(fā)揮抑制流感病毒復(fù)制作用。說(shuō)明hnRNP F蛋白可能通過(guò)與流感病毒的RNA結(jié)合而阻止核酸出核來(lái)發(fā)揮抑制流感病毒的作用。

關(guān)鍵詞：免疫共沉淀;hnRNP F蛋白;RNA;流感病毒

中圖分類號(hào)：S852.65文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Bdoi：10.3969/j.issn.2096-3637.2022.01.003

Heterogeneous Ribonucleoprotein F Inhibit Replication of Influenza Virus and Study of Molecular Mechanism

MA Huiling 1，REN Junzheng2，ZHAO Mengjiao3，JIANG Bo4，XUE Ruixue1，WANG Min1，WANG Yang1，CHEN Jing1

（l.Shandong Provincial Center for Animal Control and Prevention，Jinan 250100，China;2.College of Life Science，Shandong Agricultural University，Tai'an 271000，China;3.Yantai Centre for Animal Control and Prevention，Yantai Shandong 264003，China;4.Rongcheng City Li Island Animal Husbandry and Veterinary Station，Weihai Shandong 264300，China）

Abstract：Influenza virus is an RNA virus that replicates in the nucleus. During the replication process，a lot of virus RNA exists in the nucleus. In the process of influenza virus replication，there will be numbers of host proteins in the nucleus involved in virus replication. This study found that overexpressed hnRNP F protein in cells could inhibit the replication of influenza virus. Further，co-immunoprecipitation and indirect immunofluorescenc e assay demonstrated that hnRNP F could inhibit replication of influenza virus by interacting with influenza virus RNA to inhibit virus RNA out of nucleus.

Keywords：co-immunoprecipitation，hnRNP F protein，RNA;influenza virus

0引言

流感病毒（Influenza virus）屬于正黏病毒科流感病毒屬，病毒結(jié)構(gòu)由內(nèi)而外分為核芯、基質(zhì)蛋白和囊膜3個(gè)部分，基因組包含8個(gè)分節(jié)段的單股負(fù)鏈RNA（ss- RNA）。流感病毒的基因組RNA（vRNA）與核蛋白（NP）結(jié)合，并與RNA聚合酶復(fù)合體纏繞成致密的核糖核蛋白復(fù)合體（RNPs），以異源三聚復(fù)合體的形式存在于感染宿主的細(xì)胞核內(nèi)，主要參與病毒RNA的合成[1-2]。流感病毒感染的宿主范圍十分廣泛，包括其他哺乳動(dòng)物、禽類、鳥類等。

不均一性核糖核蛋白（heterogeneous nuclear ribonucleoprotein，hnRNP）是細(xì)胞核內(nèi)的一類RNA結(jié)合蛋白，包括約30個(gè)高豐度表達(dá)的成員[3-5]，這類蛋白可與新合成的不均一性RNAs（hnRNAs/pre-mRNAs）的內(nèi)含子區(qū)域結(jié)合來(lái)協(xié)助完成內(nèi)含子的剪切，并在mRNA從細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)的過(guò)程中結(jié)合mRNA來(lái)穩(wěn)定mRNA結(jié)構(gòu)[6-8]。在該蛋白家族中，有研究證明核內(nèi)蛋白hnRNP K、hnRNP A2/B1均能夠參與流感病毒的復(fù)制過(guò)程[9-10]，而hnRNP F蛋白是hnRNPs家族蛋白中一員，在細(xì)胞核內(nèi)含量豐富，參與mRNA前體的剪切、加工和運(yùn)輸?shù)裙δ躘11-12]。目前，尚未見(jiàn)有流感病毒與hnRNP F相互作用研究的相關(guān)報(bào)道。本研究通過(guò)免疫共沉淀試驗(yàn)和激光共聚焦試驗(yàn)研究了hnRNP F蛋白對(duì)流感病毒的作用，以期為抗流感病毒藥物研發(fā)提供思路。

1材料

毒株A/WSN/1933（H1N1）、293T細(xì)胞系、犬腎上皮細(xì)胞系MDCK和人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549，由本試驗(yàn)室保存;兔抗β-actin、Flag、hnRNP F多抗和鼠抗A型流感病毒NP、M1、M2、PB1、PB2、PA多抗，均購(gòu)自Thermo Fisher公司;FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG、羊抗兔IgG、HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG，均購(gòu)自Invitrogen公司。

2方法

2.1引物設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank中登錄的hnRNP F序列及流感病毒參考株的PA序列，分別設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物。

2.2真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

提取A549細(xì)胞總RNA，用Oligo（dT）引物反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以其為模板，利用設(shè)計(jì)的擴(kuò)增引物擴(kuò)增hnRNP F基因，克隆至pCMV-N-Flag中構(gòu)建真核表達(dá)重組質(zhì)粒pCMV-N-Flag-hnRNP F。

2.3hnRNP F表達(dá)上調(diào)對(duì)流感病毒復(fù)制影響的檢測(cè)

將pCMV-N-Flag-hnRNP F、pCMV-N-Flag質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。以MOI 0.01的A/WSN/1933感染過(guò)表達(dá)后的細(xì)胞，利用Western blot檢測(cè)NP、M1、M2和β-Actin蛋白的表達(dá)水平。收集的上清分別感染MDCK細(xì)胞統(tǒng)計(jì)蝕斑數(shù)量。

2.4利用激光共聚焦顯微鏡觀察流感病毒感染對(duì)hnRNP F定位的影響

于鋪有A549細(xì)胞的激光共聚焦小皿中以MOI 0.1 的A/WSN/1933感染細(xì)胞，在感染24 h后用4%多聚甲醛固定。以兔抗hnRNP F（1：500），鼠抗NP單抗（1：500）作為一抗4 ℃孵育過(guò)夜，Alexa Fluor-594結(jié)合的羊抗鼠IgG（1：500）、Alexa Fluor-488結(jié)合的羊抗兔IgG（1：500）為二抗孵育1 h，染核試劑DAPI 5 min。在激光共聚焦顯微鏡下觀察流感病毒感染對(duì)hnRNP F蛋白細(xì)胞內(nèi)定位的影響。

2.5利用免疫共沉淀試驗(yàn)檢測(cè)hnRNP F與流感病毒RNA 相互作用

分別將pCMV-N-Flag-hnRNP F質(zhì)粒和pCMV-N-Flag質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，24h后接種MOI 0.1 A/WSN/1933，感染后30 h，用RIPA裂解液（弱）4 ℃條件下裂解10～20 min，收集細(xì)胞裂解液，離心獲得上清，加入磁珠，4 ℃搖床過(guò)夜。將磁珠分為2部分：一部分利用Western blot檢測(cè)hnRNP F蛋白的表達(dá)水平;另一部分提取RNA。RNA提取后再分為2部分，一部分用Oligo （dT）引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，用WSN-PA-F1/R1引物檢測(cè)病毒mRNA水平，另一部分用Uni 12引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，用WSN-PA-F/R引物檢測(cè)病毒vRNA水平。

3結(jié)果與分析

3.1hnRNP F蛋白對(duì)流感病毒復(fù)制的影響

利用Western blot檢測(cè)hnRNP F過(guò)表達(dá)對(duì)流感病毒蛋白表達(dá)量影響，結(jié)果顯示在感染病毒8小時(shí)時(shí)，過(guò)表達(dá)hnRNP F蛋白組的病毒M2蛋白量低于對(duì)照組;感染14 h 后，過(guò)表達(dá)hnRNP F蛋白組病毒的NP、M1和M2蛋白含量都明顯低于對(duì)照組（見(jiàn)圖1 ）。不同感染時(shí)間段病毒上清進(jìn)行蝕斑滴定，結(jié)果顯示，感染后14 h和21 h過(guò)表達(dá)hnRNP F蛋白組病毒效價(jià)與對(duì)照組相比分別下降2.3倍和6.3倍（見(jiàn)圖2 ）。表明上調(diào)hnRNP F的表達(dá)能抑制流感病毒復(fù)制，所以hnRNP F表達(dá)對(duì)流感病毒的復(fù)制發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用。

3.2流感病毒感染對(duì)hnRNP F蛋白定位的影響

在未感染的細(xì)胞內(nèi)，hnRNP F蛋白定位于細(xì)胞核內(nèi)。在病毒感染的細(xì)胞內(nèi)，當(dāng)流感病毒出細(xì)胞核hnRNP F蛋白也定位于細(xì)胞核內(nèi)。表明流感病毒的感染沒(méi)有影響hnRNP F蛋白的定位。

4討論與結(jié)論

目前已有諸多文獻(xiàn)關(guān)于宿主蛋白與流感病毒相互作用的報(bào)道。而且關(guān)于hnRNP家族蛋白與流感病毒相互作用研究中，已有研究表明核內(nèi)蛋白hnRNP K能夠與流感病毒NS1蛋白相互作用而參與流感病毒復(fù)制過(guò)程[9];核內(nèi)蛋白hnRNP A2/B1能與流感病毒NP蛋白相互作用影響病毒復(fù)制[10]。

研究首先通過(guò)上調(diào)hnRNP F表達(dá)后，發(fā)現(xiàn)該蛋白可顯著抑制流感病毒復(fù)制。研究發(fā)現(xiàn)，核蛋白ANP32能夠增強(qiáng)流感病毒聚合酶活性，促進(jìn)流感病毒復(fù)制。而hnRNP F蛋白屬于細(xì)胞核內(nèi)的一種RNA結(jié)合蛋白，流感病毒的基因片段（vRNA和mRNA）需要在細(xì)胞核內(nèi)合成后出核來(lái)發(fā)揮不同功能。本研究通過(guò)免疫共沉淀試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)hnRNP F蛋白能夠與流感病毒核酸發(fā)生相互作用，而激光共聚焦試驗(yàn)顯示流感病毒感染并未影響hnRNP F蛋白的定位，說(shuō)明hnRNP F蛋白可能通過(guò)與流感病毒的RNA結(jié)合而阻止核酸出核來(lái)發(fā)揮抑制流感病毒的作用，該推測(cè)也需要進(jìn)一步的試驗(yàn)證實(shí)。而且hnRNP F蛋白抑制流感病毒功能位點(diǎn)還有待于進(jìn)一步研究，這將為抗流感病毒藥物研發(fā)提供思路。

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