基于分子對接技術雙靶向PTP1B和GSK3β潛在活性小分子的發現

吳明凱　張永豪　姜德文　龍治峰

摘要：目的 運用分子對接技術篩選出特異性作用于糖尿病雙靶向PTP1B/GSK3β靶點的潛在活性小分子，為降糖藥物的研究與開發提供依據和思路。方法 以PTP1B和GSK3β配體結合區域的晶體機構作為靶點，運用分子對接技術從小分子Specs和Chemdiv數據庫中篩選雙靶向PTP1B/GSK3β的小分子復合物的蛋白結構，刪除晶體水分子，運用AutoDockTools以晶體小分子為質心定義對接的活性位點。結果 經過疊合與PTP1B/GSK3β對接打分，并進一步對潛在活性分子與PTP1B/GSK3β相互作用模式分析，篩選出22個小分子與PTP1B/GSK3β均具有較強的結合親和力，其中小分子8019-7654、E589-4730和E589-4847三個化合物親和性最優。結論 來源于Specs和Chemdiv數據庫中的22種小分子化合物具有潛在雙靶向于PTP1B/GSK3β的活性，其中小分子化合物8019-7654、E589-4730和E589-4847可優先選擇開展降糖藥物的研究，是潛在的雙靶向于PTP1B/GSK3β活性小分子。

關鍵詞：PTP1B;GSK3β;分子對接，糖尿病

糖尿病（DM）是一種由于胰島素缺乏或胰島素功能缺陷所致，以血糖濃度升高為特征的慢性代謝性疾病，其中以2型糖尿病（T2DM）最常見，即人體無法有效利用胰島素。全球約4.22億人患有糖尿病，每年約150萬人死于糖尿病，且糖尿病病例數和發病率呈逐年增長趨勢。另據國際糖尿病聯盟（IDF）全球糖尿病概覽2021年數據顯示，在20歲到79歲的人群中，共有約5.37億糖尿病患者，糖尿病總人數預計到2030年將增至6.43億（11.3%），到2045年將增至7.83億（12.2%）。其中，中國糖尿病人數以及未診斷糖尿病人數均排名第一，總數約為2.137億人，糖尿病健康支出排名全球第二，糖尿病防控形勢嚴峻，迫切需要有效的干預策略和政策來阻止糖尿病人數的增加。目前，常用的降糖藥有胰島素及其類似物、雙胍類口服降糖藥等，但療效有限，無法防止胰島β細胞的壞死和胰島素的抵抗;并且，由于糖尿病患者需要長期用藥，且發病機制復雜，易導致藥物耐藥性增加。因此，抗糖尿病治療藥物的研究一直是國際醫學領域研究的熱點，發現新的藥物有助于緩解當前困局。

PTP1B（蛋白質酪氨酸磷酸酶-1B）是一種非跨膜蛋白酪氨酸磷酸水解酶，位于胞漿內質網，與蛋白絡氨酸激酶（PTK）共同維持著絡氨酸蛋白磷酸化的平衡，參與細胞信號轉導。PTP1B是胰島素信號轉導通路中的關鍵的負性調控因子，能夠阻斷胰島素信號傳導，導致葡萄糖攝取減少和胰島素抵抗，是糖尿病的有效治療靶點。

GSK3β（糖原合成酶激酶3β）參與的AMPK/GLUT4/GSK3β信號通路與糖尿病息息相關。GSK-3β在骨骼肌組織和β-胰島細胞中發揮著重要作用，GSK-3β的過表達可以阻斷糖原合成酶的活化并增加血糖，通過抑制GSK3β解除其對糖原合成酶的阻斷，并促進糖原合成，有效降低血糖濃度[1～2]。

反向虛擬篩選是一種對給定藥物或活性小分子通過計算方法找到其潛在藥物靶標的技術。本研究通過設計雙靶向于PTP1B/GSK3β的小分子抑制劑，從兩個調控位點控制糖尿病的發生和發展，針對糖尿病的耐藥具有較好的緩解作用。從PTP1B/GSK3β結構出發，采用分子對接方法AutoDock Vina和構建PTP1B/GSK3β雙靶標，采用分布式架構，構建了反向虛擬篩選平臺，對潛在雙靶向PTP1B/GSK3β小分子化合物進行有效性篩選，對于活性小分子還可以進行反向預測其潛在作用靶標，為活性化合物的后期改造和機制研究提供研究方向。該方法尤其適用于藥理活性明確，而靶標未知的中藥天然活性成分的研究，為開發新型抗糖尿病藥物提供一定的參考和思路。

1方法

1.1 PTP1B和GSK3β受體準備

查閱文獻，獲得GSK3β（PDB ID：3I4B）和PTP1B（PDB ID：2VEY）與小分子復合物的蛋白結構，刪除晶體水分子，運用AutoDockTools以晶體小分子為質心定義對接的活性位點。

1.2 配體準備

我們選擇用小分子數據庫是Specs公司和Chemdiv公司的數據庫。其中，Specs數據庫是由荷蘭Specs公司開發的數據庫，Chemdiv數據庫是由美國Chemdiv公司開發的數據庫，將篩選的小分子進行優化加氫，并用OpenBabel分子格式轉換工具轉成pdbqt格式文件。

1.3 分子對接

運用Autodock Vina軟件進行分子對接，每個配體保留9個構象，提取打分最好的構象進行分析。小分子化合物與PTP1B/GSK3β雙靶標相互作用模式用Pymol軟件可視化處理。

2結果

2.1 小分子與PTP1B和GSK3β結合情況

疊合與PTP1B和GSK3β對接打分靠前的2000個小分子發現有22個小分子是交集（圖1），即這些小分子與PTP1B和GSK3β均有較強的親和力。它們為0407-0052、3241-0275、8003-5449、8019-7654、E589-4730、E589-4749、和E589-4761等。

2.2 潛在活性分子與PTP1B和GSK3β相互作用模式

考察22個小分子與PTP1B和GSK3β的對接打分（圖2）發現，這些小分子與GSK3β的對接打分在-7.7 kcal/mol ～ -10.4 kcal/mol之間，與PTP1B的對接打分在-6.5 kcal/mol ～ -8.2 kcal/mol之間。篩選對接打分同時優于-8.0 kcal/mol的小分子為：8019-7654、E589-4730和E589-4847。

為了考察小分子化合物8019-7654、E589-4730和E589-4847與PTP1B和GSK3β的相互作用，我們進一步分析了它們之間的作用模式（圖3）。小分子化合物8019-7654、E589-4730和E589-4847與PTP1B的對接打分分別為-8.2 kcal/mol、-8.1 kcal/mol和-8.2 kcal/mol。在PTP1B體系中，8019-7654與PTP1B的Ile62、Arg141、Val135和Try134形成6個氫鍵;E589-4830與PTP1B的Ile62、Val135、Asn64和Lys85形成5個氫鍵;E589-4847與PTP1B的Ile62、Gln185和Lys85形成4個氫鍵。小分子化合物8019-7654、E589-4730和E589-4847與GSK3β的對接打分分別為-9.0 kcal/mol、-8.5 kcal/mol和-8.8 kcal/mol。在GSK3β體系中，8019-7654與GSK3β的Tyr46、Asp181、Phe182、Gln266和Arg221形成7個氫鍵;E589-4830與GSK3β的Asp48、Asp181、Ser216、Gln262和Arg221形成7個氫鍵;E589-4847與GSK3β的Asp48、Gly259、Asp181、Gln262和Arg221形成5個氫鍵。

3討論

對實驗結果進行綜合分析，發現小分子化合物8019-7654、E589-4730和E589-4847具有較好的潛在雙靶向于PTP1B和GSK3β受體。其中化合物8019-7654親和力最強，雙靶向于PTP1B/GSK3β受體對接打分為：-8.2 kcal/mol和-9.0kcal/mol。與PTP1B/GSK3β雙靶標相互作用模式分析發現，與PTP1B的Ile62、Arg141、Val135和Try134形成6個氫鍵，與GSK3β的Tyr46、Asp181、Phe182、Gln266和Arg221形成7個氫鍵，均體現出較強的氫鍵親和力。化合物E589-4730親和力次之，雙靶向于PTP1B/GSK3β受體對接打分為：-8.1 kcal/mol和-8.5kcal/mol。與PTP1B/GSK3β雙靶標相互作用模式分析發現，與PTP1B的Ile62、Val135、Asn64和Lys85形成5個氫鍵，與GSK3β的Asp48、Asp181、Ser216、Gln262和Arg221形成7個氫鍵，均體現出較強的氫鍵親和力。化合物E589-4847親和力較前兩者相當，雙靶向于PTP1B/GSK3β受體對接打分為：-8.2 kcal/mol和-8.8kcal/mol。與PTP1B/GSK3β雙靶標相互作用模式分析發現，與PTP1B的Ile62、Gln185和Lys85形成4個氫鍵，與GSK3β的Asp48、Gly259、Asp181、Gln262和Arg221形成5個氫鍵，氫鍵親和力較前兩者弱一些。可見以上三個小分子化合物具有進一步研究的價值。

分子對接模擬配體小分子物質與受體生物大分子物質相互作用的技術方法，實質就是配體與受體相互作用，包括靜電作用、氫鍵作用、疏水作用、范德華作用分子識別的過程。小分子配體與大分子蛋白受體之間通過能量匹配和幾何匹配，達到相互識別，用來模擬小分子和蛋白之間的相互作用，使我們可以通過模擬小分子在靶蛋白結合位點的行為來闡述基礎生理過程，并通過計算預測兩者間的結合模式和親和力。

4結論

綜合分析，運用分子對接Autodock軟件從Specs和Chemdiv數據庫中篩選到小分子化合物8019-7654、E589-4730和E589-4847與PTP1B/GSK3β具有較好的結合親和力，體現出一定的有效抑制性，提示這三個小分子是潛在的雙靶向PTP1B和GSK3β抑制劑，可優先選擇開展降糖藥物的研究，是潛在的雙靶向于PTP1B/GSK3β活性小分子化合物。

參考文獻

[1] 李超.海洋天然產物BDDPM靶向調控PTP1B的降糖作用及機制研究[D].北京：中國科學院大學（中國科學院海洋研究所），2019.