高效液相色譜儀的使用與故障分析

郁蕉竹 王韻 周長民 張建 許文雅 劉瀛

【摘要】本文介紹了液相色譜原理及儀器構(gòu)造，總結(jié)了在食品檢驗(yàn)檢測中使用液相色譜儀時遇到的問題及解決方法，提出了液相色譜儀的日常使用方法與注意事項(xiàng)，并對儀器的日常維護(hù)保養(yǎng)進(jìn)行了簡單介紹。

【關(guān)鍵詞】液相色譜儀;故障分析;食品檢驗(yàn)

【DOI編碼】10.3969/j.issn.1674-4977.2022.03.023

Application Instructions and Fault Analysis of High Performance Liquid Chromatograph

YU Jiao-zhu 1，WANG Yun 1，ZHOU Chang-min 1，ZHANG Jian2，XU Wen-ya 1，LIU Ying1

（1.Shenyang Food and Drug Inspection Institute，Shenyang 110122，China;2.Sinochem Lantian Fluorine Material Co.，Ltd.，Shaoxing 312300，China）

Abstract：This paper introduces the principle and instrument structure of liquid chromatography，summarizes the problems and solutions encountered in the use of liquid chromatograph in food inspection and detection，puts forward the daily use methods and precautions of liquid chromatograph，and briefly introduces the daily maintenance of the instrument.

Key words：HPLC;fault analysis;food inspection

高效液相色譜儀（HPLC）是近年來被廣泛應(yīng)用的現(xiàn)代分離分析測試儀器[1-2]。由于其具有定量分析結(jié)果準(zhǔn)確、選擇性高、檢測靈敏性高、分析速度快等優(yōu)點(diǎn)，使液相色譜法在化工、醫(yī)藥、衛(wèi)生、食品[3-5]等領(lǐng)域均有廣泛的應(yīng)用。在食品分析領(lǐng)域，液相色譜法覆蓋參數(shù)較多，包括食品添加劑、真菌毒素、污染物、農(nóng)藥殘留、維生素及營養(yǎng)強(qiáng)化劑相關(guān)的多種參數(shù)。筆者從事食品液相色譜檢驗(yàn)檢測工作多年，所在單位開展的高效液相色譜法主要測試的參數(shù)有：食品添加劑（苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸、丙酸、雙乙酸鈉、EDTA、納他霉素等）;著色劑（色素檸檬黃、日落黃、胭脂紅、莧菜紅、誘惑紅、亮藍(lán)、靛藍(lán)、新紅、赤蘚紅等）;甜味劑（糖精鈉、阿斯巴甜、阿力甜、甜菊糖甘、甜菊雙糖甘、三氯蔗糖、紐甜、甜蜜素、安賽蜜等）;真菌毒素（脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素、黃曲霉毒素、展青霉素、T-2毒素等）;污染物（多環(huán)芳烴、苯并芘）;農(nóng)藥殘留（氨基甲酸酯類農(nóng)藥及其代謝物多殘留、多菌靈等苯丙咪唑類農(nóng)藥殘留、吡蟲啉、阿維菌素、滅蠅胺、氟磺胺草醚、除蟲脲等）;維生素類（煙酸煙酰胺、維生素C、維生素A、D、E和維生素B1、B2、B6等）;營養(yǎng)強(qiáng)化劑（牛磺酸、咖啡因、肉堿、大黃酚、葛根素等）。

在日常的檢驗(yàn)工作中，液相色譜儀難免會出現(xiàn)一些問題，通常表現(xiàn)為壓力報錯、樣品不出峰或出鬼峰、保留時間漂移、基線不穩(wěn)等[6-7]。本文依據(jù)食品檢驗(yàn)檢測多年積累的工作經(jīng)驗(yàn)，對液相色譜儀在食品檢驗(yàn)檢測日常操作中出現(xiàn)頻次較高的問題提出行之有效的解決方法，并對儀器的日常維護(hù)保養(yǎng)進(jìn)行簡單介紹。

1液相色譜儀

1.1液相色譜原理

圖1為液相色譜的原理圖。如圖1所示，當(dāng)混合樣品注入色譜柱后，每個組分有一部分被吸附或溶解在固定相中，而另一部分仍留在流動相中，在色譜柱中連續(xù)不斷的反復(fù)在兩相間進(jìn)行分配交換，最終達(dá)到分配平衡。每個組分在固定相和流動相之間的分配系數(shù)不同，分配系數(shù)大的組分由于在固定相中停留的機(jī)會較多而移動速度較慢，分配系數(shù)小的組分由于在固定相中停留的機(jī)會較少而移動速度較快。所以，這就導(dǎo)致各組分在色譜柱內(nèi)形成差速遷移，最終相互拉開距離而被分離。通過檢測器對被分離組分的濃度進(jìn)行檢測，通過數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進(jìn)行定量。

1.2液相色譜儀器構(gòu)造

圖2為高效液相色譜儀的構(gòu)造。如圖2所示，高效液相色譜儀由分離單元、色譜柱、檢測器、數(shù)據(jù)處理單元組成。

1.2.1分離單元

液相色譜分離單元是一個集成的溶劑和樣品管理平臺，是在液相色譜上機(jī)操作中最需要注意和維護(hù)最多的一個單元。它主要由溶劑系統(tǒng)和進(jìn)樣系統(tǒng)構(gòu)成。溶劑系統(tǒng)主要包括真空脫氣裝置、高壓輸液泵、比例閥、在線過濾器、單向閥[8];進(jìn)樣系統(tǒng)包括針頭清洗泵、進(jìn)樣注射器裝置、定量環(huán)。分離單元可以控制以下功能：真空脫氣、溶劑混合、樣品進(jìn)樣。

1.2.2色譜柱

色譜柱是高效液相色譜儀實(shí)現(xiàn)分離過程的核心部件。液相色譜柱由柱體、柱內(nèi)填料和兩端接頭組成。色譜柱多為15～30 cm的直型柱，一般為金屬材質(zhì)。樣品中各組分在色譜柱上完成分離。食品液相檢驗(yàn)檢測中使用的色譜柱以C18為主，止匕外，常用的還有C30柱、氨基柱等。

1.2.3檢測器

檢測器將色譜柱分離出樣品的物理或化學(xué)特性轉(zhuǎn)換為可以測量的電信號。食品檢驗(yàn)檢測工作中常用的檢測器有紫外檢測器、二極管陣列檢測器、蒸發(fā)光檢測器、示差折光檢測器、熒光檢測器。

1.2.4數(shù)據(jù)處理單元

數(shù)據(jù)處理單元可以設(shè)置系統(tǒng)參數(shù)、監(jiān)視樣品運(yùn)行、處理檢測數(shù)據(jù)。檢測器檢測的電信號通過色譜圖記錄下來，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時間、峰面積、光譜圖等參數(shù)，對樣品中待測物質(zhì)進(jìn)行定性定量分析。

2液相色譜儀故障分析及解決辦法

液相色譜儀在日常使用過程中難免會出現(xiàn)一些故障。最常見的故障有系統(tǒng)失壓、系統(tǒng)超壓、基線不穩(wěn)、不出峰或出鬼峰。本文就檢驗(yàn)過程中最常見的儀器故障及解決方法進(jìn)行總結(jié)。

2.1系統(tǒng)失壓

系統(tǒng)失壓的原因包括：1）溶劑系統(tǒng)故障。檢查溶劑瓶中是否有液體，流動相是否走空，溶劑管路中是否存在氣泡。2）漏液。注意檢查色譜柱兩端是否擰緊，接頭處是否存在漏液現(xiàn)象。3）檢查流動相濾頭是否堵塞。濾頭堵塞可能導(dǎo)致溶劑無法進(jìn)入管路，導(dǎo)致系統(tǒng)失壓。系統(tǒng)失壓的解決辦法見圖3[9]。

2.2系統(tǒng)超壓

系統(tǒng)超壓的原因包括：預(yù)柱、色譜柱堵塞;在線過濾器堵塞;單向閥堵塞;管路堵塞。故障排查方法遵循分段方法，從系統(tǒng)末端，分段的去除管路或模塊。系統(tǒng)超壓故障排查方法如圖4所示。

需要注意的是，單向閥由閥套和閥芯組成，紅寶石材質(zhì)的閥芯容易被乙睛黏住，造成單向閥堵塞。若高效液相色譜儀上次工作使用乙睛作為流動相，則可能因單向閥紅寶石閥芯被乙睛黏住而造成系統(tǒng)超壓。如遇這種情況，可先對水相管路脫氣10-20 min，期間打開排液閥，用注射器多次向外抽氣，直到抽出液體，再對乙腈相及其他要用的管路脫氣，即可發(fā)現(xiàn)各管路脫氣壓力正常。該方法可在無須拆卸和清洗單向閥的情況下，簡單、快捷、高效地解決單向閥堵塞問題。

2.3基線噪音或漂移過大

基線噪音或漂移過大的原因及解決辦法如下：1）色譜柱平衡時間不夠，特別是流動相含有離子對試劑的條件下，需要色譜柱平衡時間較長。2）系統(tǒng)壓力波動大。可能由于溶劑管路中有氣泡導(dǎo)致，對各管路脫氣，并查看脫氣壓力。若脫氣壓力不穩(wěn)，可能由于溶劑濾頭堵塞導(dǎo)致溶劑無法正常輸入系統(tǒng)，管路中出現(xiàn)大量氣泡，此種情況應(yīng)取下溶劑濾頭并清洗。3）系統(tǒng)中有漏液地方，應(yīng)分段排查。4）檢測器流通池有氣泡，用純甲醇沖洗檢測器或增加平衡時間。5）檢測器流通池污染，查看檢測器燈能量。

2.4不出峰或出鬼峰

系統(tǒng)壓力正常，流動相及管線條件正常，儀器條件均正常的條件下，標(biāo)準(zhǔn)樣品不出峰，可能的原因及解決辦法如下：

1）比例閥故障。需向廠家報修，更換比例閥。2）進(jìn)樣針故障。清洗進(jìn)樣針。3）色譜柱故障。清洗或更換色譜柱。4）檢測器故障。查看并設(shè)置燈能量參數(shù)。

3高效液相色譜儀使用中的注意事項(xiàng)

3.1對流動相的要求

1）保持貯液瓶清潔，定期清洗或更換;2）流動相使用HPLC級溶劑和試劑，且經(jīng)過過濾以除去雜質(zhì)微粒，使用溶劑過濾裝置，選擇水膜或有機(jī)膜（0.45 μm或0.22 μm），通過真空泵抽氣過濾，同時要定期清洗流動相濾頭，以防雜質(zhì)通過其進(jìn)人流動相;3）流動相必須預(yù)先脫氣，否則易產(chǎn)生氣泡，影響泵的工作，此外，溶解在流動相中的氧能與某些有機(jī)溶劑形成有紫外吸收的絡(luò)合物，提高背景吸收，在梯度洗脫時造成基線漂移或形成鬼峰;4）含有緩沖鹽的流動相使用不得超過2天，防止產(chǎn)生細(xì)菌污染管路。

3.2對進(jìn)樣的要求

1）樣品進(jìn)樣前要用濾膜過濾;2）在樣品量少時，需用內(nèi)插管，需在方法參數(shù)設(shè)置時調(diào)整針頭高度參數(shù)，避免進(jìn)樣時內(nèi)插管將進(jìn)樣瓶插碎。

3.3色譜儀開機(jī)時的注意事項(xiàng)

1）運(yùn)行方法之前對實(shí)驗(yàn)所用的溶劑管路脫氣，并注意觀察脫氣時壓力，保證管路是灌注過的;2）使用緩沖鹽時，要先用大比例水沖洗色譜柱，再用方法所用的流動相平衡色譜柱;3）平衡時間一般為20 min左右，再打開檢測器。

3.4色譜儀關(guān)機(jī)時的注意事項(xiàng)

1）不要阻塞脫氣機(jī)的排空管路（不要將其放到廢液瓶中）;2）使用緩沖鹽溶液后要用大比例水相將其從系統(tǒng)中沖走，管路最終保存在純甲醇中;3）色譜柱進(jìn)樣完成后應(yīng)按照不同色譜柱的要求，保存在純甲醇、乙腈或其他溶劑中，色譜柱卸下保存時，要蓋上蓋子，避免固定相干枯;4）檢測完畢要及時關(guān)閉檢測器燈。

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