草莓莖尖組織培養技術研究

蒲忠貴 張慶全

摘要：為建立完善的草莓組培快繁體系，解決種苗退化問題，以當地草莓主栽品種紅顏莖尖為試材，設置0.1%升汞和0.1%升汞+2%吐溫-80溶液2種外植體消毒處理，以MS為基本培養基，分別添加不同濃度6-芐氨基腺嘌呤（6-BA）和萘乙酸（NAA）的6個誘導和繼代增殖培養基、5個生根培養基，研究草莓莖尖外植體消毒最佳方式與時間， 篩選誘導、繼代增殖及生根培養的最佳培養基。結果表明，0.1%升汞+2%吐溫-80溶液處理8 min時草莓莖尖污染率及褐化率較低，萌發率最高，可達82.3%，為最佳的消毒方式。外植體在MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA培養基中，可誘導出更多的健壯不定芽，萌發率為83.3%，為最佳誘導培養基;適宜的繼代增殖培養基為 MS+1.0 mg/L 6-BA +0.02 mg/LNAA，增殖系數為4.5%;1/2MS+0.01 mg/L NAA為最佳生根培養基，生根率高達100%。

關鍵詞：草莓;莖尖;快繁;組織培養

中圖分類號：S668.4? ? ? ? ? ? 文獻標志碼：A? ? ? ? ? ? 文章編號：1001-1463（2022）09-0086-04

doi：10.3969/j.issn.1001-1463.2022.09.020

Study on the Tip-shoot Tissue Culture Techniques for Strawberry

PU Zhonggui， ZHANG Qingquan

（Agriculture and Rural Bureau at Yongjing County， Yongjing Gansu 731600， China）

Abstract： In order to improve the strawberry tissue culture and rapid propagation system and to address the quality degradation issue in seedlings， taking tip-shoots of a main strawberry variety Hongyan as material， two explant disinfection methods were used i.e.， 0.1% HgCl2 solution and 0.1% HgCl2 plus 2% Tween-80 solution， 6 induction media and multiplicative culture media and 5 rooting culture media based on MS culture base plus different concentrations of 6-BA and NAA were formulated to study the optimum explant disinfection method and time， and to select the optimum culture media for induction， multiplicative culture and rooting culture for tip-shoot tissue culture of strawberry， respectively. Results showed that 0.1% HgCl2 plus 2% Tween-80 solution treated for 8 min had the lowest pollution rate and browning rate of tip-shoot tissue， and the highest germination rate of 82.3%， which was considered as the optimum explant disinfection method. The optimum induction medium was MS plus 1.0 mg/L 6-BA plus 0.2 mg/L NAA which could induce more health adventitious buds with a germination rate of 83.3%. The optimum medium for multiplicative culture was MS plus 1 mg/L 6-BA plus 0.02 mg/L NAA which had a multiplication coefficient of 4.5%. The optimal medium for rooting was 1/2MS plus 0.01 mg/L NAA which showed a rooting rate of 100%.

Key words： Strawberry; Tip-shoot; Rapid propagation; Tissue culture

草莓為薔薇科草莓屬多年生草本植物，漿果色澤艷麗，鮮美可口，營養豐富，深受人們喜? ? 愛[1 - 3 ]。草莓在全國各地均有種植。近年來，永靖縣把發展草莓產業作為鄉村振興的重要抓手積極推進， “劉家峽草莓”已享譽蘭州、西寧、臨夏等周邊城市。目前，全縣種植面積達到220 hm2，全部以日光溫室和鋼架、竹架大棚的形式保護地種植，主栽品種以紅顏和妙香系列為主，分布在三塬、峴塬、劉家峽、太極等川塬鄉鎮。采摘期從每年元月份開始，長達7個月，平均產量達37 500 kg/hm2。主要銷往蘭州、西寧、臨夏等周邊城市以及以電商物流的形式銷往全國各地，電商率達到40%。但近年來，草莓種植戶為追求經濟效益，盲目擴大種植面積，同時由于種植草莓周期長，種苗以匍匐莖繁殖和分株繁殖等無性繁殖方式為主，造成種苗種性退化快、花葉病等病毒病感染率高，導致果實畸形，果個不大，產量和質量下降。從北京、山東、遼寧等種苗繁育基地引進的草莓脫毒種苗，由于地域差異或者脫毒苗本身問題，草莓產量很不穩定，種植戶對優質草莓種苗的渴求愈發強烈。我們以紅顏草莓匍匐莖莖尖作為外植體，研究了草莓莖尖培養技術，以期為完善草莓莖尖組培快繁技術體系奠定基礎。

1? ?材料與方法

1.1? ?外植體制備

供試草莓品種為紅顏，大田生產種苗，于5 — 6月份采集種植于永靖縣三塬鎮兩合村鋼架大棚內的草莓匍匐莖尖作為外植體。

1.2? ?外植體消毒

表面消毒劑選用0.1%升汞和0.1%升汞+2%吐溫-80溶液。消毒劑消毒時間設4、6、8、10、12 min共5個水平10個處理（表1），消毒后接種于MS培養基上，篩選出最佳消毒方法。

從健壯的紅顏草莓母株上，選取飽滿稚嫩的匍匐莖2～4 cm長的頂芽，用紗布包好，流水沖洗1～2 h后瀝干，在超凈工作臺中用75%酒精消毒30 s，迅速用無菌水沖洗4～5次，隨即用0.1%升汞+2%吐溫-80溶液處理8 min，再用無菌水沖洗4～6次。

1.3? ?芽誘導培養

消毒后的外植體用濾紙吸干水分，在雙目解剖鏡下剝去幼葉露出莖尖生長點，用解剖針挑去小于0.5 mm的莖尖生長點，立即接入誘導分化培養基（表2）中，每瓶接5個，10瓶為1個處理，重復3次。用封口膜綁扎好后放置在培養架上。觀察統計萌發芽數和生長狀況，篩選出最佳芽誘導培養基。

1.4? ?繼代增殖培養

將萌發的草莓莖尖轉接到繼代增殖培養基（表3）中，每瓶接種5個叢生芽，各接種10瓶。觀察統計增殖芽數、增殖系數和芽生長狀況，篩選出適宜的繼代增殖培養基。

1.5? ? 生根培養

待繼代培養結束后，立即轉入到生根培養基（表4）中，每瓶接種5株健壯幼苗，各接10瓶。觀察統計試管苗生長狀況、平均根長、平均根數、平均生根株數，篩選出最佳生根培養基。

1.6? ?培養方法與條件

培養溫度為22～26 ℃，光照時間14 h/d，光照強度1 600～2 000 lx。培養基MS、1/2MS、1/4MS均添加蔗糖3%，瓊脂6.5 g/L，pH 5.8。

1.7? ?統計方法

接種10 d后統計污染率、褐化率。接種20 d后統計萌發率。接種30 d后統計增殖芽數，計算增殖系數和生根率。

增殖系數=（增值芽數/原個體數）×100%

1.8? ?數據處理

數據采用Excel 2003和SAS 9.1統計軟件進行統計分析。

2? ?結果與分析

2.1? ? 不同消毒劑和處理時間對莖尖外植體消毒效果的影響

經消毒處理的外植體接種7～10 d后，外植體周圍出現褐化現象，但15 d后褐化逐漸減輕。從表1可知，0.1%升汞附加2%吐溫-80溶液的處理消毒效果較好，消毒4、6、8、10 min的污染率和褐化率均比0.1%升汞單一處理低，莖尖萌發率均高于0.1%升汞單一處理?？赡芴砑油聹?80溶液作為水包油型乳化劑在降低褐化方面具有特殊機理[4 ]。從表1還看出，0.1%升汞+2%吐溫-80處理隨著消毒時間從4、6、8、10、12 min延長，污染率也從58.3%、43.4%、25.3%、21.9%逐漸降低為20.4%，當消毒時間為8 min時，莖尖萌發率最高，達82.3%。已萌發的莖尖在后期培養中發現，處理時間越短，莖尖長勢越迅速，同時褐化率較低，莖尖生長也較快。因此，0.1%升汞+2%吐溫-80處理8 min為草莓匍匐莖莖尖脫毒最佳的消毒方式。

2.2? ? 不同誘導培養基上外植體的誘導效果

從表2可以看出，草莓莖尖在MS+1.0 mg/L 6-BA +0.2 mg/LNAA培養基上誘導效果較好，萌發率為83.3%，為最佳誘導培養基。從不同濃度的6-BA來看，高濃度的6-BA會影響莖尖的正常分化與生長，同時NAA濃度也影響到莖尖萌發率。當6-BA濃度為1.0 mg/L，NAA濃度為0.1、0.2 mg/L時的生長狀況均較好，幼苗健壯，萌發芽數和萌發率均較高。說明6-BA對草莓組培苗影響較大，外植體分化培養基中6-BA的最適濃度為1.0 mg/L。同時，NAA的濃度也影響到莖尖的萌發率，其濃度為0.1 mg/L 萌發率遠低于0.2 mg/L，說明適當提高NAA含量有助于促進草莓莖尖的誘導。

2.3? ?草莓幼苗不定芽的繼代增殖培養效果

從表3可以看出，隨著6-BA濃度的不斷增加，草莓增殖系數呈先增后減趨勢，當6-BA濃度為1.0 mg/L、NAA的濃度為0.02 mg/L時，增殖系數達到最高，為4.5%，且增殖出的小苗長勢健壯、葉片深綠;當6-BA濃度繼續升高時，增殖系數反而有所下降，說明適于草莓幼苗不定芽增殖的6-BA最佳濃度為1.0 mg/L。因此，適宜的繼代增殖培養基為MS+1.0 mg/L 6-BA +0.02 mg/L NAA。

2.4? ?不同生根培養基上草莓組培苗的生根情況

由表4可知，草莓組培苗在5種生根培養基中均能生根，但不同的培養基中平均根數、根長及長勢均有很大差異。以1/2MS+0.01 mg/L NAA為最佳生根培養基，根數多，根系粗壯，利于后期移栽，生根率達100%。對不添加激素的培養基而言，1/4MS中的草莓植株根系纖長，長勢較弱;1/2MS中的植株根系多且長，生長健壯。表明植株對NAA濃度變化比較敏感，稍高濃度則誘導植株基部形成愈傷組織，根系雖分化較多，但生長受到抑制。

3? ?討論與結論

表面消毒劑的種類，外植體消毒時間及外植體發育時期是建立草莓莖尖快繁技術體系的關鍵步驟[4 - 5 ]。草莓匍匐莖莖尖表面長有大量絨毛，致使消毒劑通過吸附進入外植體分生組織，而吐溫-80具有潤展劑的作用，可使外植體表面絨毛與升汞更好的接觸、附著及吸入[6 - 8 ]，可提高外植體消毒效果。

試驗結果表明，用0.1%升汞+2%吐溫-80溶液處理8 min時草莓莖尖污染及褐化水平較低，成苗率最高，可達82.3%。外植體在MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA的誘導培養基中，可以誘導出更多的健壯，萌發率為83.3%，為最佳誘導培養基;適宜的繼代增殖培養基為 MS+1.0 mg/L 6-BA + 0.02 mg/L NAA，增殖系數為4.5%;1/2MS+0.01 mg/L NAA為最佳生根培養基，生根率達100%。因此，紅顏草莓匍匐莖外植體消毒時采用0.1%升汞+2%吐溫-80處理8 min效果為好。

外源激素的濃度和比例能影響培養物的基因表達，進而影響器官的分化，通過內源激素的平衡調節來達到控制器官發生的目的[8 ]。在進行草莓誘導分化、繼代增殖培養時，激素種類、濃度和配比對萌發率和增殖系數表現得尤為明顯。在增殖培養前期，使用較高濃度的6-BA能夠短期增加基數、縮短繼代周期。而在增殖后期，則較低濃度的6-BA能夠分化出較多生長良好的幼苗，便于后期生根，可提高育苗生產效率。

參考文獻：

[1] 楊馥霞，湯? ?玲，賀? ?歡，等.? 低溫下7個草莓品種的抗性生理指標比較[J].? 甘肅農業科技，2021，52（4）：14-17.

[2] 李玉亮，胡軾林，潘旭升，等.? 蘭州新區日光溫室綠色食品草莓生產技術規程[J].? 甘肅農業科技，2020（5）：91-94.

[3] 楊馥霞，湯? ?玲，賀? ?歡，等.? 取樣部位對6 個草莓品種低溫半致死溫度的影響[J].? 甘肅農業科技，2019（12）：31-34.

[4] 周厚成，何水濤.? 草莓病毒病研究進展[J]. 果樹學報，2003（5）：421-426.

[5] 肖君澤，黃益鴻，姜放軍.? 草莓病毒病及其脫毒與檢測技術研究進展[J].? 江西農業學報，2010，22（8）：88-90.

[6] 陳振光.? 園藝植物離體培養學[M].? 北京：中國農業出版社： 1996.

[7] 王振磊，閆芬芬，王? ?靜.? ?草莓組培快繁技術研究[J].? 北方園藝， 2012（11）：130-132.

[8] 崔廣榮，劉云兵，郭蕾娜.? 草莓增殖和生根壯苗培養基的篩選[J].? 園藝園林科學，2003，19（6）：210-212.