高效液相色譜-串聯質譜法測定牛奶中9種磺胺類藥物殘留不確定度的評定

張慧芳 孫文

摘 要：建立了高效液相色譜-串聯質譜法（HPLC-MS）測定牛奶中9種磺胺類藥物的數學模型，并對測定過程的不確定度進行了評估。當牛奶中磺胺二甲嘧啶、磺胺嘧啶、磺胺吡啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲異嘧啶、磺胺甲氧嘧啶、磺胺甲基異噁唑、磺胺異噁唑和磺胺二甲氧基嘧啶的含量分別為21.272 μg·L-1、22.336 μg·L-1、19.352 μg·L-1、21.312 μg·L-1、20.840 μg·L-1、22.680 μg·L-1、20.456 μg·L-1、21.816 μg·L-1和18.208 μg·L-1時，擴展不確定度分別為0.323 2 μg·L-1、0.255 8 μg·L-1、0.093 8 μg·L-1、0.127 4 μg·L-1、0.127 4 μg·L-1、0.167 6 μg·L-1、0.155 2 μg·L-1、0.083 4 μg·L-1和0.321 8 μg·L-1（k=2）。結果表明，影響檢測結果的主要因素是標準工作曲線，其次是重復性。

關鍵詞：高效液相色譜-串聯質譜法;磺胺;牛奶;不確定度

Uncertainty Evaluation of 9 Sulfonamides Residues in Milk by HPLC-MS Method

ZHANG Huifang， SUN Wen*

（Institute of Food and Grain Inspection Technology， Shanxi Inspection and Testing Center，?Taiyuan 030012， China）

Abstract： A mathematical model for the determination of nine sulfonamides in milk by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （HPLC-MS） was established， and the uncertainty of the determination process was evaluated. When the contents of sulfadimidine， sulfadiazine， sulfapyridine， sulfamerazine， sulfisomidine， sulfameter， sulfamethoxazole， sulfisoxazole and sulfadimethoxine in milk were 21.272 μg·L-1， 22.336 μg·L-1，?19.352 μg·L-1， 21.312 μg·L-1， 20.840 μg·L-1， 22.680 μg·L-1， 20.456 μg·L-1， 21.816 μg·L-1 and 18.208 μg·L-1，?the expanded uncertainties were 0.323 2 μg·L-1， 0.255 8 μg·L-1， 0.093 8 μg·L-1， 0.127 4 μg·L-1， 0.127 4 μg·L-1，0.167 6 μg·L-1， 0.155 2 μg·L-1， 0.083 4 μg·L-1 and 0.321 8 μg·L-1（k=2）. The results showed that the main sources of?uncertainty arose from the standard curve fitting and repeatability.

Keywords： high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry; sulfonamides; milk; uncertainty

磺胺類藥物（Sulfonamides）由于具有較廣的抗菌譜以及低廉的成本，在各類養殖行業被廣泛用于抑制細菌感染導致的各類疾病[1]。目前，檢測磺胺類藥物的常用方法是高效液相色譜-串聯質譜法[2]。文中測定方法參考《牛奶中磺胺類藥物殘留量的測定》（農業部781號公告—12—2006）[3]，對文件規定的9種磺胺類藥物進行檢測。根據《化學分析測量不確定度評定》（JJF 1135—2005）[4]和《測量不確定度評定與表示》（JJF 1059.1—2012）[5]評定牛奶中9種磺胺類藥物殘留檢測結果的不確定度并分析不確定度的影響因素。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

磺胺二甲嘧啶、磺胺嘧啶、磺胺吡啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲異嘧啶、磺胺甲氧嘧啶、磺胺甲基異噁唑、磺胺異噁唑和磺胺二甲氧基嘧啶的混合標準溶液（100 μg·mL-1，純度均大于99.5%，北京曼哈格公司）和13C6-磺胺甲噁唑（純度均大于99.5%，德國Dr.Ehrenstorfer公司）;甲酸、甲醇、乙腈均為色譜純（德國默克公司）;牛奶選用磺胺類陰性備用樣品。

1.2 儀器與設備

5500 QTRAP高效液相色譜-串聯質譜儀（美國SCIEX公司）;KDC-140HR臺式高速冷凍離心機（安徽中科中佳科學儀器公司）;BSA124S-CW電子天平（瑞士梅特勒-托利多集團）。

1.3 標準溶液配制與加標樣制備

乙腈溶解13C6-磺胺甲噁唑固體配制100 μg·mL-1的內標儲備溶液，再用乙腈稀釋得100 ng·mL-1的內標工作液。用超純水稀釋內標工作液得到12.5 ng·mL-1的內標稀釋液，用內標稀釋液稀釋4種磺胺類混合標準液得到含有磺胺標準品濃度為0.5 ng·mL-1、1.0 ng·mL-1、2.0 ng·mL-1、5.0 ng·mL-1、10.0 ng·mL-1、20.0 ng·mL-1、50.0 ng·mL-1、100.0 ng·mL-1和200.0 ng·mL-1，內標濃度為12.5 ng·mL-1的標準溶液。將不同濃度標準溶液加入磺胺陰性牛奶中充分溶解獲得加標牛奶樣品，冷藏備用。

1.4 樣品前處理

參照《牛奶中磺胺類藥物殘留量的測定》（農業部781號公告—12—2006）中的處理方法。

1.5 儀器條件

液相色譜條件：C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，3.5 μm）;流速0.8 mL·min-1;柱溫35 ℃;進樣量

2 μL;流動相0.02%甲酸水+0.02%甲酸乙腈，梯度洗脫。質譜條件：電噴霧離子源正模式;掃描方式為多反應監測模式;脫溶劑氣溫度500 ℃;氣簾氣壓力50 psi;霧化氣壓力50 psi;內標法定量。

2 結果與分析

2.1 數學模型

9種磺胺含量的計算公式為

式中：X為樣品中被測物質含量，μg·L-1;，C為試液中被測物質濃度，ng·mL-1;V為試液的定容體積，mL;f為樣品溶液稀釋倍數;V為樣品體積，mL。

2.2 不確定度來源

根據測量過程和建立的數學模型，該檢測方法的不確定來源主要有：①配制標準溶液引入的不確定度;②樣品量取引入的不確定度;③擬合標準曲線引入的不確定度;④重復性引入的不確定度。

2.3 不確定度的評定

2.3.1 配制標準溶液引入的相對標準不確定度ur（s）

該過程引入的不確定度由稱量標準物質以及標準溶液移取體積的不確定分量組成。

稱量使用電子天平由檢定證書得到最大允差為0.000 3 g，假定符合均勻分布，包含因子，則有標準不確定度為u（m）=0.000 173 2 g，稱取13C6-磺胺甲噁唑質量為0.01 g，其相對標準不確定度為ur（p）=u（m）/m=0.017 32。

標準溶液的配制過程見1.3描述，構成體積的不確定度分量由3個分量構成。

（1）100 mL容量瓶體積V1有體積和溫度兩個分量。體積提供的分量為0.01 mL，溫度提供的分量為0.395 mL。故兩分量的合成不確定度u（V1）=0.399 mL，由定容體積V1引入的相對標準不確定度為ur（V1）=0.003 99。

（2）1 mL移液槍體積V2只包含體積分量。由1 mL移液槍體積V2引入的相對標準不確定度為ur（V2）=0.005 774。

（3）200 μL移液槍體積V3只包含體積分量。由200 μL移液槍體積V3引入的相對不確定為ur（V3）=0.002 309 4。100 mL容量瓶使用兩次，1 mL的移液槍和200 μL

移液槍各使用了8次，根據不確定度合成公式，配制標準溶液引入的相對標準不確定度ur（s）為0.025 32。

2.3.2 樣品量取引入的相對標準不確定度ur（V）

樣品用200 μL移液槍量取定容，其產生的不確定度有體積和重復性兩個分量。

（1）體積。根據JJG 646—2006規定，200 μL移液器容量允差為±0.4%，即±0.000 8 mL，近似于矩形分布，=0.000 461 88 mL，由移液槍體積V1引入的相對標準不確定度為ur（V1）=0.002 309 4 mL。

（2）重復性。JJG 646—2006給出6次測定的RSD≤0.2%。得標準偏差S≤0.2×0.2%=0.000 4 mL。

兩分量合成不確定度為u（V）=0.002 34 mL。

因此，由樣品量取定容體積V引入的相對不確定度為ur（V）=0.011 7。

2.3.3 擬合標準曲線引入的不確定度ur（curve）

校準工作曲線線性回歸方程為A=B1ρ+B0，回歸曲線由儀器軟件計算得到。

由此樣品溶液中磺胺類含量的標準不確定度計算公式為

式中：u（ρ）為樣品溶液中被測組分的標準不確定度;s為校準工作曲線殘余標準偏差;m為樣品溶液濃度x的測量次數，為2;n為校準工作曲線的測量次數，

為6;ρ為樣品溶液中被測組分濃度與內標濃度比的平均值（取2倍定量限濃度）：ρ（xz）為工作標準溶液濃度與內標濃度比的平均值，ρ（xz）=3.453;ρi為第i個校準溶液的濃度與內標濃度比，i=9;校準工作曲線引入的相對標準不確定度公式為

由上述公式計算得到的9種磺胺類藥物校準工作曲線引入的不確定度計算結果分別為0.229 7、0.172 1、

0.068 1、0.084 1、0.083 0、0.109 3、0.112 3、0.049 8和0.267 4。

2.3.4 重復性實驗引入的不確定度ur（rep）

對陰性樣品以2倍定量限加標（加標樣的理論濃度為2.50 ng·mL-1）后，加標樣品6次重復測定。按正態分布計算，重復性的標準不確定度為。因此，重復性測定的相對標準不確定度為。由上述公式計算得到9種磺胺相對標準不確定度為0.023 4、0.019 1、0.009 5、0.022 7、0.026 7、0.007 9、0.009 3、0.013 1和0.030 5。

2.3.5 合成標準不確定度和擴展不確定度U

合成不確定度為，，取包含因子k=2，擴展不確定度為，由上述公式計算得到磺胺類藥物的不確定度評定結果如表1所示。

3 結論

通過對高效液相色譜-串聯質譜法測定牛奶中9種磺胺類物質含量的不確定來源進行分析，對不確定度分量進行量化和合成，當牛奶中9種磺胺類物質含量分別為21.272 μg·L-1、22.336 μg·L-1、19.352 μg·L-1、21.312 μg·L-1、20.840 μg·L-1、22.680 μg·L-1、20.456 μg·L-1、21.816 μg·L-1和18.208 μg·L-1時，擴展不確定度分別為0.323 2 μg·L-1、0.255 8 μg·L-1、0.093 8 μg·L-1、0.127 4 μg·L-1、0.127 4 μg·L-1、0.167 6 μg·L-1、0.155 2 μg·L-1、0.083 4 μg·L-1和0.321 8 μg·L-1（k=2）。在實際操作過程中應提高標準工作曲線的測定頻率、增加重復次數、盡量使用混標，減少單標混合引起的誤差、選擇精度較高的吸量容器，從而確保標準曲線具有良好的線性和穩定性，實驗數據具有良好的重復性。

參考文獻

[1]張夢雪，趙義良，蘇青，等.水產品中磺胺類藥物殘留危害及常用檢測方法[J].今日畜牧獸醫，2019，35（7）：79-80.

[2]李朔，張璨，馬玲，等.QuEChERS結合超高效液相色譜-串聯質譜法同步測定魚肉制品中24種磺胺類抗生素[J].食品工業科技，2022，43（9）：301-308.

[3]中華人民共和國農業部.牛奶中磺胺類藥物殘留量的測定液相色譜-串聯質譜法[EB/OL].（2006-12-16）[2022-06-05].http：//www.agri.cn/shichang/nybz_23263/200803/t20080321_1028668.htm.

[4]國家質量監督檢驗檢疫總局.化學分析測量不確定度評定：JJF 1135—2005[S].北京：中國計量出版社，2005.

[5]國家質量監督檢驗檢疫總局.測量不確定度評定與表示：JJF 1059.1—2012[S].北京：中國標準出版社，2012.