miR-451在雌激素誘導大鼠乳腺增生中的作用機制研究*

張潔妤，曹 飛，陳春香，王 敏，何云巖，鄧仕標，余 婷

(南昌大學撫州醫學院，江西 撫州 344000)

乳腺增生癥又稱為乳腺結構不良癥，是乳腺組織增生及退行性變，與內分泌功能紊亂密切相關，是中年女性最常見的乳腺疾病，常表現為乳房疼痛和(或)乳腺觸及結節，嚴重時影響女性正常工作和生活。有研究表明，乳腺增生可使患者罹患乳腺癌的風險增加2～5倍。乳腺增生的發病機制錯綜復雜，對其分子機制的研究多集中于內分泌激素紊亂方面[1-2]，在基因水平，特別是非編碼RNA對其發生、發展影響方面的研究很少見。本研究檢測了微小RNA(miR)-451基因及雌激素受體(ER)、細胞周期蛋白D1(Cyclin D1)、B淋巴細胞瘤-2基因(Bcl-2)在大鼠乳腺增生組織中表達的差異，探討了miR-451與乳腺增生發生、發展的相關性，旨在為臨床治療提供新思路。

1 資料與方法

1.1資料

1.1.1研究對象 2020年6月選取20只大鼠作為研究對象。采用隨機數字表法將其分為乳腺增生組和對照組，每組10只。

1.1.2主要試劑與儀器 黃體酮注射液購自浙江仙琚制藥股份有限公司(規格：1 mL含黃體酮20 mg)，苯甲酸雌二醇注射液購自上海通用藥業股份有限公司(規格：1 mL含雌二醇2 mg)，Trizol購自美國英杰生命技術有限公司，定量逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)試劑盒購自日本TaKaRa公司，逆轉錄試劑盒購自美國英杰生命技術有限公司，聚偏氟乙烯電轉膜購自美國默克密理博公司，丙烯酰胺購自美國Amresco公司，瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自美國歐米伽生物科技公司，脫脂奶粉購自中國北大荒完達山乳業股份有限公司，曝光用顯影粉/定影粉購自中國天津市鑫洋醫療器械有限公司，電泳儀購自中國北京六一儀器廠，移液器購自德國艾本德公司，PCR 擴增儀購自美國賽默飛世爾科技公司，生物安全柜購自中國蘇州安泰空氣技術有限公司，7500實時定量PCR儀購自美國賽默飛世爾科技公司，Western-blotting儀購自中國上海天能科技有限公司，UVP-GDS8000 凝膠成像系統購自美國斯博明科學器材公司。

1.2方法

1.2.1造模 乳腺增生組大鼠采用雌、孕激素序貫法造模，按體重0.5 mg/(kg·d)于大鼠后肢后外側肌內注射苯甲酸雌二醇，每天1 次，左右交替，連續注射25 d，繼而改用黃體酮注射5 mg /(kg·d)，每天1 次，連續注射5 d。對照組大鼠肌內注射生理鹽水每只0.1 mL，每天1 次，連續注射30 d。

1.2.2標本采集 處死2組大鼠后分別切下10 g乳腺組織，經生理鹽水處理后放置-80 ℃冰箱中保存備用。

1.2.3定量RT-PCR檢測 使用RNA 提取試劑盒提取總RNA，在逆轉錄反應體系下進行逆轉錄，體系條件設定：16 ℃、30 min，42 ℃、30 min，75 ℃、15 min，4 ℃保存。將miR-451反轉錄為第一鏈cDNA，再以反轉錄得到的第一鏈cDNA為模板實施PCR擴增：引物10 pmol/L；95 ℃變性10 min，95 ℃、15 s；60 ℃、1 min，40個循環。內參為U6，并按以下公式計算拷貝數：目標基因△循環數(Ct)值=目標基因Ct值-同一樣本 U6 Ct值。目標組的△Ct為平均值減去其對照的平均△Ct值得到每個目的基因相對Ct值(△△Ct值)，即△△Ct為目標基因=處理組△Ct值，即目標基因-對照組△Ct值目標基因。基因相對表達量采用2-ΔΔCt方法計算。△Ct=Ct miR-451-Ct U6，△△Ct= (Ct miR-451-Ct U6)乳腺增生組-(Ct miR-451-Ct U6)對照組。

1.2.4Western-blotting檢測 取標本碾磨后按常規方法提取總蛋白，在收集的蛋白樣品中加入適量濃縮的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺蛋白上樣緩沖液。沸水浴加熱3～5 min，以充分變性蛋白。冷卻到室溫后將蛋白樣品直接上樣至十二烷基硫酸鈉-聚丙稀酰胺膠加樣孔內。經聚丙烯酰胺凝膠電泳處理后轉移至聚偏二氟乙烯膜上，放置于預先準備好的洗滌液中，漂洗1～2 min，以洗去膜上的轉膜液。用5%脫脂奶粉封閉1 h，結合一抗過夜后用緩沖液清洗3次，每次5 min，加入二抗室溫孵育2 h，用緩沖液清洗3次，每次5 min，加入ECL顯色劑，壓片曝光、顯影，經Quantity one軟件掃描后進行灰度分析。

2 結 果

2.12組大鼠乳腺組織miR-451表達比較 對照組大鼠乳腺組織miR-451表達量是乳腺增生組大鼠的1.75倍。見表1。

表1 miR-451基因PCR擴增結果

2.22組大鼠乳腺組織ER、Cyclin D1、Bcl-2 蛋白表達比較 乳腺增生組大鼠乳腺組織ER、Bcl-2蛋白相對表達明顯高于對照組，差異均有統計學意義(P<0.05)；2組大鼠乳腺組織Cyclin D1蛋白相對表達量比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 2組大鼠乳腺組織ER、Cyclin D1、Bcl-2蛋白表達比較

2.3miR-451與ER、Bcl-2蛋白表達的相關性 miR-451與ER、Bcl-2蛋白表達呈明顯負相關(r=-0.87、-0.79，P<0.05)。

3 討 論

作為育齡女性常見疾病之一，乳腺增生增加了患者罹患乳腺癌的風險，同時，隨年齡增加發生惡變的風險也隨之增加。當前，我國人口結構老年化趨勢日益嚴重，乳腺癌發病風險居高不下，特別是在一些經濟發達地區，乳腺癌已位居女性惡性腫瘤發病首位。因此，從分子水平闡述乳腺增生的發病機制、探討新的治療靶點、積極給予早期干預對降低乳腺增生的惡化具有積極意義。

miRNA是一類內生的、長度為20～24個核苷酸的非編碼單鏈小分子RNA，其在細胞內具有多種重要的調節作用。目前為止，已被發現的miRNA超過1 000種，其可通過與靶基因的不完全配對，抑制靶向基因的表達，從而間接參與細胞代謝、增殖、分化、凋亡等過程[3-4]。

ALTUVIA等[5]在2005年最早提取了miR-451，其位于染色體17q11.2，與原癌基因ERBB2區域相鄰。有研究發現，miR-451可能參與了調控惡性腫瘤細胞[6-8]、增生性瘢痕成纖維細胞[9]、增生型糖尿病視網膜[10]等增殖。如WANG等[11]在對非小細胞肺癌的研究中發現，miR-451能顯著抑制RAB14蛋白的表達，而RNA介導沉默RAB14的表達能呈現出miR-451抑制腫瘤生長的作用，修復RAB14的表達后miR-451的抑癌作用將部分消失。巢海潮等[12]研究表明，膀胱癌組織中miR-451表達量明顯低于正常膀胱組織，同時，其表達與膀胱癌患者臨床分期及病理分級密切相關。

本研究以miR-451為導向，探討了其對乳腺增生上皮細胞ER、Cyclin D1、Bcl-2的影響，旨在為更好地了解乳腺增生發病機制提供參考依據，結果顯示，乳腺增生組大鼠乳腺組織miR-451表達量明顯低于對照組，ER、Bcl-2蛋白相對表達量均明顯高于對照組。黃君華等[13]通過病例對照研究也發現，ER在乳腺增生患者體內表達量升高。ER的高表達在ER信號傳導機制中也具有非常重要的作用，作為雌激素核受體，ER通過直接或間接方式與特異DNA位點——雌激素反應元件(ERE)結合而發揮轉錄效應。ERE具有2個反向的回文基序PUGGTCA 。ER以ER-或ER-同二聚體或ER-/ER-異二聚體形式與ERE結合。ER結合的親和力及特異性取決于基序的序列和空間結構。除通過ERE直接傳遞信號外，ER更多的是作為輔激活因子與其他結合DNA的轉錄因子(AP1、SP1等)相互作用來調節轉錄。此外，有研究發現，ER與細胞外信號調節激酶、內皮型一氧化氮合酶的表達均存在關聯性，并在乳腺增生的發生、發展中具有關鍵作用[14-15]。

Bcl-2蛋白家族位于細胞內膜系統中，已發現25種Bcl-2家族同源蛋白，其成員中有些促進凋亡，如Bad 、Bid 、Bax 等，有些成員阻止細胞凋亡，如Bcl-2、Bcl-x、Bcl-w等。Bcl-2能阻止細胞色素C從線粒體釋放至細胞質，從而抑制了細胞凋亡[16-18]。焦丹等[19]通過觀察性研究發現，無腋窩淋巴結轉移的乳腺癌患者Bcl-2陽性表達率明顯高于有腋窩淋巴結轉移者。劉云等[20]采用半定量法檢測了Bcl-2在直腸癌中的表達，結果顯示，Bcl-2蛋白表達與腫瘤分化程度、TNM分期、術前血清癌胚抗原水平、淋巴結轉移有關。本研究結果顯示，乳腺增生組大鼠乳腺組織Bcl-2蛋白表達量明顯高于對照組，提示高表達Bcl-2蛋白可能抑制乳腺上皮細胞凋亡，從而間接促進乳腺上皮細胞增生。因此，miR-451可能通過調控ER表達進而影響ER信號傳導，并調控Bcl-2蛋白表達從而抑制乳腺組織細胞凋亡，誘導乳腺增生的發生、發展。本研究下一階段計劃培養大鼠乳腺上皮細胞進一步通過使用miRNA轉染技術使miR-451過表達，應用反義寡核苷酸技術抑制miR-451表達，探討miR-451對大鼠乳腺上皮細胞形態和凋亡的影響，為闡述乳腺增生的發生、發展提供科學依據。