過氧化物消毒劑消毒效力驗證

＊李曉婷 靳朝暉 曲曉蒙 秦煥美 潘亞華

（北京民海生物科技有限公司 北京 102600）

采用實驗室消毒劑效力硬表面測試方法，使用標準試驗微生物在使用濃度下將消毒液覆于表面，在規定時間內，確定挑戰菌對數減少情況，證明消毒液在需要作用的表面能夠有效降低微生物水平的能力，確定消毒劑的有效性和適用性。

1.環境菌株篩選

生產車間環境控制尤為重要，本次驗證根據潔凈區常見微生物的種類以及出現的頻率、耐消毒劑程度選擇環境常見代表菌[1]，對近1年廠區內所有潔凈區環境監測出現的未知菌進行菌種鑒定，鑒定出的種屬有革蘭氏陰性桿菌（G-）、革蘭氏陽性球菌（G+），對環境常見菌的種屬及出現頻率進行統計如下：

表1 環境常見菌的種屬及出現頻率表

根據車間環境菌出現頻率和種屬選擇人葡萄球菌人亞種（G+）和放射性根瘤菌（G-）進行殺毒效果測試。

2.試驗驗證方法

此次驗證采用載體噴霧法[2]。采用實驗室消毒劑效力硬表面測試方法，使用標準試驗微生物在使用濃度下將消毒液覆于表面，在規定時間內，確定挑戰菌對數減少情況，證明消毒液在需要作用的表面能夠有效降低微生物水平的能力，確定消毒劑的有效性和適用性。

潔凈區涉及的常見材料有不銹鋼、PVC、軟簾、硬簾、玻璃、彩鋼板，選取此6種材質進行試驗，同時參照清潔衛生管理要求，用消毒劑作表面消毒濕潤5min，以確認復方過氧化物的消毒效力。

本次試驗選取標準菌株中較難殺滅的枯草芽孢桿菌、黑曲霉、白色念珠菌和環境菌中出現頻次較高的人葡萄球菌人亞種、放射性根瘤菌進行驗證。

(1)物料信息

①消毒劑

復方過氧化物消毒劑:純化水=1:19（20倍稀釋）。

②中和劑

本方案采用化學中和法[2]。在消毒劑與微生物作用達到規定時間的終點時，加入足量中和劑將殘留消毒劑迅速中和，使其不再持續抑制或殺滅微生物的方法。

中和劑用于消除試驗微生物與消毒劑的混懸液中以及微生物表面上殘留的消毒劑（即：在一定的反應時間后終止消毒劑對微生物的殺滅作用）。根據“過氧化氫消毒液的中和劑篩選試驗研究（1001-7658（2010）02-0132-03）楊洪等”選取10g/L硫代硫酸鈉[3]（例：硫代硫酸鈉10g，注射用水定容至1L。）作為中和劑。

(2)試驗前準備

①材料的準備

A.培養基：胰酪大豆胨瓊脂培養基（TSA）、胰酪大豆胨液體培養基（TSB）、沙氏葡萄糖瓊脂培養基（SDA）。B.稀釋液：滅菌的0.9%氯化鈉溶液。C.載體：不銹鋼、PVC、軟簾、硬簾、玻璃、彩鋼板，6種材質板：長×寬：15cm×15cm的材質板各3塊。D.中和劑：10g/L硫代硫酸鈉溶液，0.22μm濾膜除菌過濾后備用。E.TPS：胰蛋白胨1.0g、氯化鈉8.5g，用900mL純化水溶解，并調節pH值在7.0±0.2，最終用純化水定容至1000mL，121℃、30min濕熱滅菌后使用。F.挑戰菌株：枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉、人葡萄球菌人亞種（G+）、放射性根瘤菌（G-）。G.消毒劑：使用純化水配制成適宜濃度，裝入無菌噴瓶中備用。H.其他試驗設施和條件：已校驗的1.0mL滅菌移液槍及所配槍頭；1次性10mL刻度吸管；生物安全柜；振蕩器；培養箱；記號筆；無菌酒精；無菌擦片；棉拭子。

②菌懸液制備[4-5]

A.芽孢菌懸液的制備。取QC儲備的枯草芽孢桿菌第2代菌種，接種于胰酪大豆胨液體培養基，于30～35℃培養18～24h，即為第3代培養物。用10.0mL吸管吸取5.0～10.0mL第3代的18～24h胰酪大豆胨液體培養物，接種于平皿中胰酪胨大豆瓊脂培養基表面，將其搖動使菌液布滿胰酪胨大豆瓊脂培養基的表面，再將多余肉湯培養物吸出，將平皿置于30～35℃溫箱內，培養5～7d。固定染色在顯微鏡（油鏡）下進行鏡檢。當芽孢形成率達95%以上時制備芽孢懸液。芽孢液于80℃水浴10min以殺滅殘余的細菌繁殖體，待冷至室溫后于2～8℃冰箱中備用。芽孢懸液在使用時，應先進行活菌培養計數。實驗用菌懸液的含菌量根據計數結果和實驗要求進行調配。

B.白色念珠菌懸液的制備。取QC儲備的白色念珠菌第2代菌種，接種于沙氏葡萄糖瓊脂培養基，于20～25℃培養2～3天，即為第3代培養物。試驗時，取第3代斜面培養物在沙氏葡萄糖瓊脂斜面上連續傳代，方法與第3代相同，制備第4代培養物。

C.黑曲霉懸液的制備。取QC儲備的黑曲霉第2代菌種，接種于沙氏葡萄糖瓊脂培養基，置20～25℃培養箱中培養5～7天，即為第3代培養物。取第3代平板培養物接種于沙氏葡萄糖瓊脂培養基平皿中，20～25℃培養5～7天。即為第4代培養物。

D.人葡萄球菌人亞種（G+）、放射性根瘤菌（G-）。取QC凍存的人葡萄球菌人亞種菌種（或放射性根瘤菌），接種于胰酪大豆胨液體培養基，于30～35℃培養18～24h。用10.0mL吸管吸取5.0～10.0mL的18～24h胰酪大豆胨液體培養物，接種于胰酪胨大豆瓊脂培養基表面，將其搖動使菌液布滿胰酪胨大豆瓊脂培養基的表面，再將多余肉湯培養物吸出，將平皿置于30～35℃溫箱內，培養18～24h。培養物用10.0mL吸管加10.0mL稀釋液于平皿中，以L棒輕輕推刮下菌苔。吸出第一批洗下的菌懸液，再向瓶內加5.0mL稀釋液，重復洗菌一遍。將第一和第二批洗下的菌懸液集中于一含玻璃珠的無菌三角燒瓶中，振搖5min，打碎菌塊，使成均勻的菌懸液。注：以上菌懸液制備完成后在2～8℃儲存，當天使用不得過夜。

③菌片制備

用清潔劑清潔每一材質板，并用純水仔細潤洗；用75%乙醇消毒后晾干備用。在每種材質板上標記直徑為10mm圓形區域，每個區域認為是一個載體片，在Nd和Nc染菌。吸取0.01mL菌懸液點接到載體片表面，并用接種環使菌液在表面充分鋪展開來（1×106～5×106CFU/片）。

每種材質按上圖染菌，孔間間距≥5cm。以等邊三角形排列。

3.結果和討論

(1)中和劑效力確認

表2 中和劑效力試驗結果

①中和劑毒性組NC

用于驗證中和劑本身是否會對微生物產生抑制/殺滅作用。吸取0.1mL濃度為1×106～5×106cfu/mL的試驗菌懸液于試管內，加入0.4mL TPS（模擬代替消毒液），混勻。加入4.5mL中和劑，作用10min。計數得NC。

②中和產物毒性組NT

中和劑與消毒劑混合之后形成的體系稱為“中和產物”，本組用于驗證中和產物是否會對微生物產生抑制/殺滅作用。吸取0.1mL濃度為1×106～5×106cfu/mL的試驗菌懸液于試管內，吸加4.9mL中和產物溶液（以0.4mL消毒劑加4.5mL中和劑，作用10min配制而成）于試管內，混勻。作用10min，計數得NT。

③對照組N0

菌數對照，用于驗證在無任何抑菌效果條件下（使用TPS）相應的微生物數量，該數值用于與前2組結果的對比評判。吸取0.1mL濃度為1×106～5×106cfu/mL的試驗菌懸液于試管內，吸加0.4mLTPS于試管內，混勻。加入4.5mL稀釋液，作用10min，計數得N0。

④中和劑驗證計算

記錄每個稀釋度1.0mL樣品的菌落數。選取一個合適梯度的讀數，該梯度的2塊平板的讀數（記為a和a’）都應處于30cfu至300cfu之間（霉菌為10cfu至100cfu之間）。然后用以下公式計算NC、NT和N0，中和劑毒性試驗記為NC，中和劑效力試驗記為NT，對照組試驗記為N0：

表3 挑戰菌水平下降對數單位結果統計表

其中：d=稀釋液的稀釋系數；NC=log10中和劑毒性測試中初始混合液菌濃度；NT=log10中和劑效力測試中初始混合液菌濃度；N0=log10對照組測試中初始混合液菌濃度。

⑤可接受標準[6]

(2)硬面測試

將每種菌所染載體片分開進行試驗。每批試驗以同一濃度消毒劑溶液（或TPS）對Nd（Nc）組菌片進行均勻噴霧。

操作：將消毒劑噴灑在載體菌片的表面，作為消毒劑效力測試試驗（Nd）；將TPS溶液噴灑在載體片的表面，作為陽性對照（Nc）；另選取未染菌的載體片，將TPS溶液噴灑在載體片表面，操作與陽性對照試驗完全一致，作為陰性對照。陰性對照試驗結果不允許有菌生長。

待試驗菌（或TPS）與消毒劑相互作用至規定時間，立即用無菌拭子擦拭各消毒后的載片區域，然后再將拭子頭折斷投入相應的預裝有5mL中和劑（對于Nd組）或者5mL稀釋液（對于Nc組）的試管中，中和10min后，通過充分震蕩的方法將拭子上的微生物全部洗脫至試管中。

然后移取1mL試管中的液體到已標記過的培養皿中做平板計數，每管接種2個平皿。對于菌數對照組，則按照10倍稀釋的操作依次稀釋3～4支試管（預裝有4.5mL稀釋液）并根據預計菌液濃度選擇不少于2個稀釋梯度進行平板計數。

白色念珠菌倒置于20～25℃培養1～3天，霉菌應將平板正置于20～25℃培養3～7天，芽孢倒置于30～35℃培養3～7天，人葡萄球菌人亞種（G+）倒置于30～35℃培養1～3天，放射性根瘤菌（G-）倒置于30～35℃培養1～3天，拋棄那些長的太多不能計數的平板，將剩余的平板計數。

(3)計算與結果表達

①記錄每個梯度1.0mL樣品的菌落數(a，a’)。a和a’的平均值都應處于30cfu至300cfu之間（霉菌為10cfu至100之間），然后用以下公式計算Nc和Nd，即每個載體平面上恢復生長的菌落數的對數值。

其中：d=稀釋液的稀釋系數；NI，NII，NIII陽性對照或消毒劑測試中每個菌片上恢復生長的菌落數；Nc=log10陽性對照中每個菌片上的菌落數；Nd=log10消毒劑測試中每個菌片上的菌落數。

②用以下公式計算Log下降值。Log下降值=Nc-Nd；若下降值超過了5，一律以＞5來表示。計算每一種測試菌株的Log下降值。

③可接受標準。硬面測試為載體定量殺滅試驗，即在一定的接觸時間內，消毒劑能夠使挑戰菌水平下降3個對數單位。

(4)討論

本次驗證為過氧化物消毒劑在實驗室的消毒效力研究。通過消毒劑消毒效力驗證后再進行潔凈區現場消毒效果的驗證，以確認消毒劑對不同消毒對象（環境、產品和工藝）的有效性及適用性。

4.結論

通過消毒劑滅活效果驗證可知，中和劑以及中和劑與消毒劑的中和產物對挑戰菌種生長無不良影響，在一定的接觸時間內消毒劑能夠使挑戰菌水平下降3個對數單位，表明該消毒劑消毒效力能滿足日常消毒使用。