一種新型植物乳桿菌素的分離純化研究

＊王金澤 劉哲 黃一剛 裴金金,2,3,4*

（1.陜西理工大學 生物科學與工程學院 陜西 723000 2.陜西省資源生物重點實驗室 陜西 723000 3.陜南秦巴山區生物資源綜合開發協同創新中心 陜西 723000 4.陜西理工大學秦巴生物資源與生態環境省部共建國家重點實驗室（培育） 陜西 723000）

細菌素具有優勢，因為它們無毒、高抗菌活性和良好的選擇性[1]。因此，它們有望在食品工業中用作抗菌劑/防腐劑[2]。馴養牦牛在青海省已經飼養了數千年。牦牛干酪含有不同的微生物含量，這取決于原產牛奶和發酵環境的不同。因此，它可能是細菌素產生菌分離的理想來源。盡管從許多其他來源[3]分離出細菌素已有報道，但目前從青海牦牛乳干酪中分離到細菌素的報道還很少。本研究從青海牦牛乳干酪分離株Lb的上清液中分離純化出一種新的細菌素植物乳桿菌素SLG1，命名為Lb.植物乳桿菌SLG1。在本研究中，我們還對植物乳桿菌素SLG1的理化性質進行了表征。

1.材料與方法

(1)產細菌素乳酸菌(LAB)的篩選

①乳酸菌（LAB）的分離

傳統的青海牦牛奶酪是從當地市場購買的。然后將牦牛奶酪切成20g/片，并將它們均化至均勻。然后將奶酪加入100mL MRS肉湯中并在30℃溫育。溫育24h后，使用培養環將液體懸浮液涂在MRS板上。將革蘭氏陽性且過氧化氫酶陰性的菌暫定為乳酸菌（LAB）[4]。無細胞上清液（CFs）是通過離心和0.26mm微過濾器過濾獲得的[5]。以金黃葡萄球菌指示菌株CICC10384為指示菌株，采用牛津杯法測定CFS對金黃色葡萄球菌的抗菌活性[6]。

②產細菌素乳酸菌的鑒定

使用鑒定試劑盒（API 50CHL，BioMerieux，法國Montalieu Vercie）根據菌株的碳水化合物發酵模式進行初步鑒定[4]。采用27F和1492R引物通過16SrRNA基因序列分析對該細菌菌株進行基因型鑒定[7]。然后將序列提交給NCBI使用BLAST進行分析，來比較相似性。

(2)菌株SLG1生產細菌素的研究

將細菌素產生菌接種于MRS培養基，30℃培養，每隔4h測定一次抗菌活性和pH值。

(3)細菌素的提純

①納米磁性脂質體的制備

鐵磁性Fe3O4納米顆粒是用水熱方法制備的[8]。將蛋黃磷脂酰膽堿（EYPC，最低98%純度）和1,2-dimyristoylsn-glycerophosphatidylglycerol（鈉鹽，最低97%純度）（2:1，w/w）溶解在氯仿/甲醇（2:1，v/v）中，用薄膜分散法制備納米磁性脂質體顆粒[9]。

②細菌素的篩選與純化

將細菌素產生菌的胞外發酵液與磁性脂質體在30℃下混合24h，將細菌素吸附到磁性脂質體中，以含50mM NaCl的PBS（pH7.2，10mm）為等度流動相，在25℃下分離磁性脂質體中的細菌素，在215nm處測定吸光度。收集具有吸收峰的洗脫組分，并用牛津杯法分析其抗菌活性[6]。蛋白質濃度用Brodf定量[5]進行測試。收集活性最高的洗脫液。采用高效液相色譜法（Waters Symmetry C18柱，250±4.6mm，5mm，愛爾蘭都柏林）梯度分離（流動相B：5e 100%），流速0.5mL/min，25℃，流動相（A）0.05%（v/v）三氟乙酸（TFA）和流動相（B）100%乙腈。

(4)結構特征

對純化的細菌素進行氨基酸序列測定（Procise491，ABI，USA）。使用NCBI BLAST算法進行同源性搜索。用HyperChem7.5軟件預測細菌素的三維結構。

(5)細菌素的抗菌活性及其特性研究

針對表1中列出的指示菌株測試了細菌素活性。MIC為最小抑菌濃度，即最低抑菌濃度，在微生物鑒定的稀釋法中以在試管內或小孔內完全抑制細菌生長的最低藥物濃度為最低抑菌濃度。MBC為最小殺菌濃度，即殺死99.9%（降低3個數量級）的供試微生物所需的最低藥物濃度。并采用掃描電鏡對比觀察經細菌素處理和未經細菌素處理的金黃葡萄球菌的形態，研究細菌素的抗菌活性及抗菌機理。

表1 細菌素的抗菌活性

續表

2.結果與分析

(1)SLG1菌株的分離與鑒定

從青海牦牛干酪中分離到17株潛在的實驗室菌株。通過調節上清液的pH至6.5并檢測其抑菌活性，排除了有機酸對實驗室細菌生長抑制活性的可能性。從中篩選出9株細菌素產生菌。由于SLG1菌株能同時抑制革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌（金黃色葡萄球菌CICC10384的生長），本研究選擇該菌株進行進一步研究。根據API 50CHL系統和16SrDNA鑒定表明，SLG1菌株為植物乳桿菌，命名為植物乳桿菌SLG1。

乳酸菌產生的細菌素由于其安全的性質和高的抑菌活性，近年來引起了人們的極大關注。此外，牦牛奶制成的奶酪被認為可以治療胃炎疾病，還含有各種各樣的微生物群落[10]。因此，它可能是分離細菌素產生菌的一個潛在來源。

(2)細菌素的產生

植物乳桿菌SLG1是在對數生長期產生的，最高產量出現在穩定期中期（從27h到36h）。這表明植物素SLG1的產生依賴于細胞數量，它可能是一種次生代謝物。在一些實驗室細菌素中也觀察到了類似的結果，如植物乳桿菌2a產生的細菌素2a，由乳酸鏈球菌產生的細菌素R1333。

(3)細菌素的純化

從磁性脂質體中洗脫出三個組分，洗脫液#3顯示最高的抗菌活性，然后使用RP-HPLC從洗脫液#3中純化獲得細菌素SLG1。乳酸菌細菌素的傳統方法通常涉及復雜的色譜過程[11-12]，雖然有效，但過于復雜，通常涉及三個以上的凈化步驟。例如，細菌素R1333是從乳酸菌的上清液中提純出來的，經硫酸銨沉淀、凝膠過濾、反相高效液相色譜（RPHPLC）分離。人們認為，所有細菌素，無論其作用機制如何，都需要與目標細菌細胞膜交換才能發揮活性[13]。基于這一觀點，本研究旨在利用磁性脂質體吸附和反相高效液相色譜（RP-HPLC）兩步法快速篩選能夠與菌膜結合的抗菌肽，作為一種簡便有效的純化方法。

(4)植物乳桿菌素的結構特征

細菌素SLG 1的10個氨基酸序列被成功鑒定為Tyr-GlyAsn-Gly-Val-Phe-Ser-Val-Ile-Lys。當嘗試進行NCBI BLAST同源性分析時，未檢測到與任何已知肽的相似性。因此，該細菌素被確定為一種新的多肽，命名為植物乳桿菌素SLG1。用生物信息學工具預測其結構，結果如圖1所示，成無規則卷曲狀態。據報道，許多細菌素在水溶液中具有隨機卷曲狀態[9]，這種結果可能使其更容易插入細菌細胞膜。

圖1 用HyperChem7.0軟件計算得到的植物乳桿菌素SLG1的三維結構

(5)植物乳桿菌素SLG1的抗菌活性及其特性研究

植物乳桿菌素SLG1對枯草芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、黃色微球菌、嗜熱梭狀芽孢桿菌、酪酸梭菌、金黃色葡萄球菌、無毒李斯特菌和白紋伊氏菌均具有良好的抗菌活性（表1）。掃描電鏡觀察結果顯示，經細菌素SLG1處理后的金黃葡萄球菌細胞皺縮、破裂，細胞內容物流失從而導致細胞死亡。說明SLG1可通過作用敏感菌細胞膜，造成胞膜通透性增加，細胞結構破壞的方式發揮其抗菌機制。

圖2 植物乳桿菌SLG1(2MIC)對敏感微生物細胞形態的影響

3.結論

本研究從牦牛奶干酪中分離篩選獲得細菌素產生菌植物乳桿菌SLG1。建立磁性脂質體吸附結合反相高效液相色譜（RP-HPLC）的有效純化細菌素的新方法，并純化獲得一種新型細菌素，命名為植物乳桿菌素SLG1。其氨基酸序列為YGNGVFSVIK。該細菌素對枯草芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、黃色微球菌、嗜熱梭狀芽孢桿菌、酪酸梭菌、金黃色葡萄球菌、無毒李斯特菌和白紋伊氏菌具有良好的抗菌活性。此外，植物乳桿菌素SLG1可以增加細胞膜的通透性，導致孔洞形成和最終細胞死亡。最后，這種細菌素具有作為一種有前途的抗菌劑的潛力，可用于進一步的食品或醫療應用。