HPLC測定蒲公英中4種有機酸含量并優化提取純化工藝

＊王倩楠 石錦峰 鄭家勤 王晗毓 董自波,2*

（1.江蘇海洋大學藥學院 江蘇 222005 2.海洋藥用資源開發工程研究中心 江蘇 222005）

引言

蒲公英（Taraxacum mongolicum Hand.-Mazz.）屬多年生草本植物，廣泛分布于我國西南和西北等地區，是一種藥食同源的中藥材資源[1]。現代研究表明，蒲公英富含有機酸、黃酮、多糖、甾醇、三萜等有效成分[2-3]。蒲公英有機酸包括綠原酸、咖啡酸、菊苣酸、單咖啡酰酒石酸、阿魏酸等，具有抗炎、抗菌、抗氧化等作用[4]。此外，菊苣酸還能降脂、降糖、提高人體免疫力[5]。蒲公英臨床可用于胃潰瘍和上呼吸道感染等疾病治療[6]。作為產量大、價廉易得的中藥，優化提取純化工藝，可加大利用率，提高經濟和社會效益。

1.儀器與材料

(1)材料

蒲公英購自安徽井泉中藥股份有限公司；單咖啡酰酒石酸、綠原酸、菊苣酸、咖啡酸（純度≥98%）購自上海源葉生物科技有限公司；NKA-2、NKA-9、HPD-450、DA201、AB-8大孔樹脂購自北京索萊寶科技有限公司；Agileant-XDA-8 C18柱購自安捷倫科技有限公司；超純水、蒸餾水自制；甲醇、乙腈為色譜級；其余試劑為分析純。

(2)主要儀器

島津DGU-20A3R高效液相色譜儀；UV-1800PC型紫外可見分光光度計；ES1035A型電子分析天平；FRQ-1010HT型數控超聲波清洗機；KMD型加熱套；Spring-R30型超純水儀。

2.方法與結果

(1)綠原酸、咖啡酸、菊苣酸和單咖啡酰酒石酸的含量測定

①色譜條件

色譜條件：流動相A為乙腈，流動相B為0.1%磷酸-0.04%三乙胺-0.02%二正丁胺溶液，梯度洗脫（0～4min 5%～10%A；4～12min 10%～20%A；12～21min 20%～40%A；21～23min 40%～50%A；23～24min 50%～5%A；24～29min 5%A），流速1.0mL·min-1，檢測波長為328nm，柱溫35℃，進樣量10μL。

②對照品與供試品的制備

精密稱取菊苣酸、咖啡酸、綠原酸與單咖啡酰酒石酸對照品于容量瓶中，70%甲醇超聲后定容至刻度；另精密吸取對照品儲備液置于同一量瓶后定容，制成含菊苣酸、咖啡酸、綠原酸與單咖啡酰酒石酸83.62μg/mL，20.36μg/mL，9.46μg/mL和101.8μg/mL的混合對照品。取蒲公英提取物于容量瓶中，加入70%甲醇超聲15min后定容，取續濾液作為供試品溶液。

③系統適用性研究

精密吸取“2.1.2”項下制備的混合對照品與供試品溶液，于“2.1.1”項下色譜條件下進樣并記錄色譜圖1。

圖1 HPLC對照品

④線性關系考察

精密量取混合對照品1mL、2mL、4mL、6mL、8mL、10mL置20mL容量瓶后定容，進樣1次。以質量濃度為橫坐標（x），峰面積為縱坐標（y）繪制。單咖啡酰酒石酸、綠原酸、咖啡酸和菊苣酸的回歸方程分別為：y1=14700x-11272（R1=0.9997）、y2=80568x-3794.9（R2=0.9992）、y3=58958x+12381（R3=0.9996）和y4=24413x-14939（R4=0.9998）。結果表明，單咖啡酰酒石酸、綠原酸、咖啡酸和菊苣酸質量濃度分別5.09～50.9μg，0.47～4.73μg，1.02～10.18μg和4.18～41.81μg的范圍內線性關系良好。

⑤精密度試驗

取同一份對照品溶液，按“2.1.1”項色譜條件重復進樣6次，記錄峰面積，計算單咖啡酰酒石酸、綠原酸、咖啡酸、菊苣酸峰面積的RSD分別為0.27%，0.86%，0.21%，1.65%（n=6），RSD＜2%，符合規定，表明儀器精密度良好。

⑥穩定性試驗

取同一份供試品溶液，室溫下放置0h、2h、4h、8h、12h、16h、20h、24h后分別進樣，單咖啡酰酒石酸、綠原酸、咖啡酸、菊苣酸RSD分別為1.72%，0.46%，0.07%，0.16%（n=8），RSD＜2，符合規定，說明24h內穩定性良好。

⑦重復性試驗

取同一份供試品溶液平行制備6份，分別進樣1次，計算單咖啡酰酒石酸、綠原酸、咖啡酸和菊苣酸的含量和RSD為1.57%，1.48%，1.03%，1.80%，RSD＜2%，表明該方法重復性良好。

⑧回收率試驗

精密稱取1mL蒲公英純化物，共6份，并加入單咖啡酰酒石酸、綠原酸、咖啡酸和菊苣酸對照品儲備液，按“2.1.2”項下方法制備加樣供試液，進樣1次，計算加樣回收率。結果得單咖啡酰酒石酸、綠原酸、咖啡酸和菊苣酸的平均回收率為100.97%，97.46%，101.54%，99.62%，RSD分別為0.85%，1.76%，0.93%，0.32%，該方法準確度好。

(2)純化工藝研究

①樹脂的預處理與上柱液的制備

將NKA-2、NKA-9、HPD-450、DA201、AB-8樹脂用95%乙醇浸泡24h，充分溶脹后濕法裝柱，用95%乙醇洗脫直至流出液無白色渾濁后，水洗至無醇味。取40g蒲公英熱水提取，第一次加水15倍，提取1.5h，第二次加水12倍，提取1h，合并濾液，即得。

②大孔吸附樹脂篩選

錐形瓶中加入20mL大孔樹脂與40mL上柱液，室溫震蕩24h，測定續濾液、乙醇洗脫液中單咖啡酰酒石酸、綠原酸、咖啡酸和菊苣酸的量，計算吸附率、解吸率、吸附量，以菊苣酸和單咖啡酰酒石酸為主比較，結果如表1、表2所示，優選DA201樹脂。

表1 5種大孔樹脂的吸附率（%）與吸附量（μg/mL）

表2 5種大孔樹脂的解吸率（%）

③最大吸附量考察

取樹脂25mL，上柱液150mL，以2.0BV·h-1流速進行吸附，分段收集流出液，每5mL測定蒲公英總有機酸的峰面積，以編號為橫坐標，計算質量濃度為縱坐標，繪制泄露曲線。結果如圖2所示，在第22份出現明顯的泄露行為，除去殘留水體積14mL，總上柱量為96mL，即1mL DA201樹脂可以吸附3.8mL的蒲公英提取液。

④吸附流速考察

取DA201樹脂25mL，上柱液100mL，分別以0.5BV·h-1、1.0BV·h-1、1.5BV·h-1、2.0BV·h-1、3.0BV·h-1流速進行吸附。收集流出液后，檢測4種有機酸的峰面積，計算有機酸含量與吸附率。結果如表3所示顯示，隨著流速加快，吸附率越小，表明樹脂交換率下降，流速過慢則時間成本增加，不利于工廠生產，故選1.5BV·h-1為最佳流速，即保障有機酸富集量最大又提高效率。

表3 不同吸附流速下的吸附率（%）比較

⑤洗脫流速的考察

取上樣液按照最佳條件吸附后，用3BV 50%乙醇以1.0BV·h-1、2.0BV·h-1、3.0BV·h-1、4.0BV·h-1、5.0BV·h-1流速進行洗脫，收集解吸液，按照“2.1.2”項目下進行制樣，測定蒲公英4種有機酸含量，計算解析率。結果顯示，4種有機酸含量先增加后降低，解析率隨洗脫流速的加大而下降，結合提取效率與結果綜合分析，2.0BV·h-1為最優洗脫流速。

⑥洗脫溶劑濃度考察

取大孔樹脂并按上述條件吸附后，將30%、50%、80%、95%乙醇以2.0BV·h-1流速進行洗脫，用量為3BV，測定洗脫液里各有機酸含量。如表4所示，乙醇濃度為80%時，洗脫物中總有機酸含量最高。

表4 5種大孔樹脂解吸液的濃度（mg/g）

⑦洗脫溶劑體積考察

取DA201樹脂吸附后，用10BV 80%的乙醇進行洗脫，流速2.0BV·h-1，每1BV分段收集，測定菊苣酸的含量并計算累計解析率，以流份為橫坐標，累積解吸率為縱坐標作解吸曲線。由圖2可知，5BV的乙醇可將有機酸基本解吸完全，確定洗脫液體積5BV。

圖2 總有機酸的泄露曲線

圖3 菊苣酸的泄露曲線

⑧驗證實驗

取25mL DA201樹脂和125mL提取液，以1.5BV·h-1流速進行吸附和4BV水洗后，最后用5BV 80%乙醇以2BV·h-1的流速洗脫，平行3次。菊苣酸、單咖啡酰酒石酸、咖啡酸、綠原酸平均質量濃度分別為2.8752mg/g、0.8167mg/g、0.3407mg/g、0.1469mg/g，有效成份大幅提高，吸附與洗脫良好。

3.討論

我國蒲公英分布廣泛、產量大、價廉易得，對其提取分離純化工藝進行優化，加大其利用率，可以提高其經濟效益。本實驗以蒲公英4種有機酸為指標，優選DA201大孔樹脂，上樣體積為4BV，吸附流速為1.5BV·h-1，4BV洗滌用水量，5BV 80%乙醇以2.0BV·h-1的流速洗脫，純化后，4種有機酸含量大幅提升，效果良好。