黏著劍菌CN-02胞外多糖在緩解水稻Cu2+脅迫中的作用

＊孫科 沙鳳 譚芳美 熊美惠

（蘇州科寧多元醇有限公司 江蘇 215000）

引言

近年來，隨著社會經濟的發展，由人類活動引起的土壤重金屬污染日趨嚴重。在我國，生態環境部基于全國土壤污染狀況調查結果顯示，農田土壤超標率達19.4%，其中主要以鎘（Cd）、鎳（Ni）、銅（Cu）、汞（Hg）、鉛（Pb）等為主。研究人員發現，銅脅迫下，若土壤中的銅含量超過50mg/kg，則會影響柑橘的生長；若土壤中的銅含量超過200mg/kg時，則會嚴重抑制小麥生長。另一方面，重金屬通過食物鏈進入生物體內，對其造成極大的危害。因此，減少重金屬離子在植物體內的富集、增強植物重金屬脅迫抗性，對于我國糧食安全至關重要。

胞外多糖是由微生物分泌的胞外聚合物，其由單糖通過糖苷鍵的形式連接而成。由于單糖種類豐富、糖苷鍵不同以及側鏈修飾差異，使得自然界中的胞外多糖多種多樣，其效果也不盡相同。其中，胞外多糖中的羥基、羧基、硫酸基團等官能團，對金屬離子的吸收至關重要。山東大學侯萬國教授團隊[1]研究發現，富含羥基、羧基的深海中溫菌Wangia profunda SM-A87胞外多糖對Pb、Cu、Cd有較強的吸附能力。Mukherjee等[2]發現，砷（2mM）增加了Halomonas sp.Exo1胞外多糖的產生，進而又隔離了重金屬，緩解了水稻的重金屬脅迫，表現出正反饋機制。鑒于胞外多糖較好的陽離子吸附特性，胞外多糖及其分泌菌株已被建議作為重金屬修復的輔助劑[3]。

黏著劍菌（Ensifer adhaerens）屬于α-變形菌門細菌，其最早由Casida于1982年從土壤中被分離鑒定。隨著研究的深入，人們發現黏著劍菌是優異的土壤有機污染物降解和工業化生產維生素B12菌種。也有研究表明，來源于黏著劍菌的胞外多糖是一種良好的食用油生物乳化劑[4]。在本研究中，我們發現黏著劍菌CN-02具備較強的胞外多糖分泌能力，且其胞外多糖富含糖醛酸，可吸附Cu2+，并緩解Cu2+脅迫對水稻生長的抑制作用。

1.材料與方法

(1)菌株

黏著劍菌（Ensifer adhaerens）CN-02篩選自水稻根際土壤，已于2020年12月保藏至中國普通微生物菌種保藏管理中心（CGMCC，No21357）。

(2)培養基

LB培養基：NaCl 10g，酵母粉5g，蛋白胨10g，溶解于1L去離子水中。

發酵培養基：NaCl 10g，酵母粉5g，蛋白胨10g，蔗糖40g，溶解于1L去離子水中。

固體培養基則額外添加15g/L瓊脂，所述培養基菌滅菌后使用。

(3)胞外多糖產量及組分測定

挑取E.adhaerens CN-02至LB液體培養基，37℃，過夜培養。隨后將其以4%接種量轉接至發酵培養基，30℃，200rpm培養24h，即得發酵液。發酵液高速離心（10000×g，15min）后保留上清，減壓蒸餾至原始體積的1/5。濃縮液通過Sevag試劑（異戊醇:氯仿=1:4v/v）去除蛋白后，加入3倍體積95%乙醇，4℃過夜醇沉。將沉淀冷凍干燥后，即得E.adhaerens CN-02胞外多糖。

胞外多糖總糖含量通過苯酚-硫酸法測定[4]；糖醛酸含量通過硫酸-咔唑法測定[5]；蛋白質含量通過Brad-Ford法測定；灰分含量通過馬弗爐測定。

(4)胞外多糖與Cu2+螯合能力測定

準確稱量12.6g無水CuSO4（含5g Cu），溶解至95mL去離子水中。隨后，加入5mL 5g/L、10g/L、20g/L、40g/L的胞外多糖溶液，以加入5mL去離子水為空白對照，充分混合后常溫靜置30min。將混合溶液在4000×g離心20min，上清液通過電感耦合等離子體光譜儀測定Cu2+含量。螯合率使用如下公式計算：

螯合率（%）=（對照組Cu2+含量－實驗組Cu2+含量）×100/對照組Cu2+含量

(5)紅外光譜分析

稱取10mg樣品與100mg KBr混合后研磨至細粉末，并通過壓片機制成薄片，使用傅里葉變換紅外光譜儀對其進行掃描。

(6)水稻種植及處理

供試的水稻種子（Oryza sativa ssp.japonica cv.Nipponbare）由江蘇省農業科學院提供。將種子用2.5%次氯酸鈉表面滅菌20min，然后用無菌水沖洗3次。在22℃催芽后，移栽至滅菌土壤中，培養一周后，挑選長勢相似的水稻幼苗，隨機分成6組，分別為：T1，空白對照；T2，施加CuSO4溶液，至終濃度為250mg/kg土壤；T3，施加胞外多糖溶液，至終濃度為100mg/kg土壤；T4，施加胞外多糖和CuSO4溶液，至胞外多糖終濃度為100mg/kg土壤，CuSO4終濃度為250mg/kg土壤；T5，施加胞外多糖和CuSO4溶液，至胞外多糖終濃度為200mg/kg土壤，CuSO4終濃度為250mg/kg土壤；T6，施加胞外多糖和CuSO4溶液，至胞外多糖終濃度為400mg/kg土壤，CuSO4終濃度為250mg/kg土壤。培養一周后，收集水稻，測定其根長、莖長、鮮重、葉綠素含量，體內Cu2+含量，丙二醛（MDA）含量[6]，脯氨酸含量[7]；收集水稻根圍土，測定游離Cu2+含量。其中，整個培養期間生長條件為：25℃、相對濕度65%、光強度4000lx、光照16h/d。

2.結果與討論

(1)胞外多糖產量及組分分析

經發酵、提取后測得E.adhaerens CN-02胞外多糖產量為8.83g/L；E.adhaerens CN-02胞外多糖中，總糖含量為74.20%，糖醛酸含量為26.18%，不含蛋白質。此外，灰分含量為4.79%。

(2)胞外多糖對Cu2+的結合能力分析

為了考察胞外多糖高糖醛酸含量的特性，是否表現出較好的Cu2+螯合能力，我們對其進行了分析。實驗結果如圖1所示，隨著胞外多糖含量（0～30g/L）的升高，其對Cu2+的螯合率逐漸升高，而30g/L與40g/L胞外多糖對Cu2+的螯合率卻無明顯差異。

圖1 胞外多糖對Cu2+的結合能力

(3)胞外多糖紅外圖譜分析(圖2)

圖2 胞外多糖在吸附Cu2+前和后的紅外光譜分析

Cu2+處理前后的E.adhaerens CN-02胞外多糖紅外光譜圖如圖2所示。根據文獻報道，胞外多糖在3400cm-1附近又寬又大的特征吸收峰為-OH的伸縮振動，在2940cm-1附近的吸收峰為糖亞甲基中C-H的伸縮振動，在1600cm-1和1400cm-1附近的吸收峰為羧酸根離子基團（COO-）和C-H的結合震動，在1070cm-1附近的吸收峰代表了C-O-C和C-O-H的伸縮振動[8]。胞外多糖吸附Cu2+后，其紅外光譜吸收峰在3400cm-1處、1600cm-1和1400cm-1處的吸收峰明顯變強，說明這些基團與胞外多糖結合Cu2+有關，而在3400cm-1和1600cm-1處的變化最為顯著，說明羧基和羥基在吸附Cu2+的過程中發揮著主要作用。

(4)胞外多糖增強水稻對銅離子脅迫的抗性

不同處理下水稻苗莖長、根長、鮮重和葉綠素含量如表1所示。重金屬脅迫處理，即T2組，顯著抑制了水稻生長，其莖長、根長、鮮重和葉綠素含量均顯著低于對照組，即T1。施加胞外多糖處理組（T3），顯著促進了水稻生長。施加胞外多糖和重金屬脅迫的處理，則顯著緩解了重金屬脅迫對水稻幼苗的傷害，其中，胞外多糖含量越高，其緩解作用越明顯，這一現象與胞外多糖濃度越高對Cu2+吸附能力越強相吻合（圖1）。

表1 不同處理下水稻苗生長指標差異

重金屬脅迫下，植物會細胞失水而進一步受到滲透壓脅迫。此時，植物會調整代謝，分泌并積累過量的脯氨酸，用于提高自身抗滲透壓脅迫的能力，從而盡量緩解重金屬脅迫對植物造成的損傷。因此，水稻在正常環境下生長時（T1和T3組），其體內脯氨酸含量較低，在重金屬脅迫下生長時（T2組），其脯氨酸含量顯著上升，為T1組的2.5倍。當施加胞外多糖后（T4、T5和T6組），水稻苗內脯氨酸含量有所下降，但仍顯著高于T1處理組圖3（A），這或許是因為胞外多糖在植物體外絮凝了Cu2+，使水稻收到了更低濃度的重金屬離子脅迫，進而其對脅迫緩解需求較小，體內脯氨酸含量也因此降低。

MDA是脂膜氧化后的最終產物。換言之，植物體內MDA含量越高，其受到的脅迫傷害越嚴重[8]。Cu2+脅迫對植物造成了明顯的傷害，使脂膜過氧化，積累了更多的MDA圖3（B），T2組的MDA含量為T組的3.1倍，這對植物造成了極大的傷害。胞外多糖處理顯著緩解了這一傷害，水稻體內的MDA與T2組相比，從29.6nmol/g降低至18.9nmol/g（T4組）、16.9nmol/g（T5組）、16.2nmol/g（T6組）。

隨后，我們考察了水稻根內外的Cu2+含量。實驗結果如圖3（C）和圖3（D）所示，在正常環境下生長的水稻（T1和T3組）根內和根外Cu2+含量低，而T2組，根內、根外Cu2+含量顯著提高，分別達到了124mg/kg和133mg/kg。胞外多糖處理后（T4、T5和T6組），水稻根內的Cu2+含量顯著降低圖3（C），有趣的是，水稻根圍土壤中的游離Cu2+含量也同樣顯著降低圖3（D）。因此，我們推測，在Cu2+脅迫下，Cu2+大量內流，顯著提高了水稻根內的Cu2+含量，而胞外多糖的加入，由于其對Cu2+較好的吸附能力，限制了Cu2+內流，同時，將Cu2+絮凝在土壤中，從而減少了Cu2+對植物生長的抑制作用。

圖3 不同處理下水稻幼苗脯氨酸（A）、MDA（B）、根內Cu2+（C）和根圍Cu2+（D）含量

3.總結

在本研究中，我們發現來源于E.adhaerens CN-02的胞外多糖中含有較多的糖醛酸含量。同時，該胞外多糖展現出了較強的Cu2+吸附能力，從紅外圖譜分析，我們推測其吸附能力主要與羧基和羥基有關。將該胞外多糖使用至模擬鹽脅迫的土壤中，其通過對Cu2+吸附效應，將Cu2+排除在水稻根際外圍，顯著增強了水稻對Cu2+脅迫的抗性。