瞬態過程研究用新型低溫生物顯微成像冷凍臺研制

張宏彬，黃永華*，韓廈，李錚

（1-上海交通大學制冷與低溫工程研究所，上海 200240；2-上海交通大學附屬第一人民醫院泌尿中心男科，上海 200080）

0 引言

低溫顯微鏡是研究生物切片組織和細胞在低溫下凍融機理的重要工具之一，它不僅包括顯微成像系統，還嵌入生物樣本冷凍、保溫和復溫功能[1-4]，通常以液氮或冷氮氣為冷源。過去幾十年中，文獻報道了多種類型的低溫顯微鏡冷凍平臺，用于觀察不同條件下的冷凍現象。根據低溫降溫方式的不同，可分為對流型和導熱型。DILLER等[5-6]較早研制了用于觀察生物細胞的對流型低溫顯微鏡，以恒定氮氣流為冷源，以載物片上的透明氧化錫鍍膜為加熱器，所設計的自動溫度控制系統可調節冷凍和解凍過程中的溫度變化率，降溫速率約100 ℃/min。鄔申義等[7]研制出國內首臺低溫顯微鏡，采用冷氮氣冷卻樣品，用水或者熱氮氣加熱樣品，并通過調控電磁閥的啟閉時間來實現溫度變化速率的控制，升降溫速率在0～100 ℃/min內可控，控溫精度為0.1 ℃，控溫范圍-196～50 ℃。NAMPERUMAL等[8]設計了一種定向固化的冷凍臺，通過使樣品橫跨冷熱臺之間微小間隙達到超高速的降溫升溫，最高能提供18 000 ℃/min的升降溫速率。張紹志等[9]研制了同樣以冷氮氣為冷源的對流型低溫顯微鏡，最低溫度約為-50 ℃，通過電子膨脹閥控制冷卻介質的流量，計算機輸出模擬信號控制鍍膜玻璃的加熱量，采用比例積分微分算法控制升降速率，實現了50 ℃/min的降溫速率以及100 ℃/min的升溫速率。范菊莉等[10]對低溫臺溫度場的分布情況進行了數值模擬和實驗驗證，發現對流型顯微鏡樣品層溫度在水平方向上基本均勻。LEGROS等[11]設計了可以通過旋轉低溫臺一次性觀察多份樣品的低溫顯微鏡，低溫臺通過一根浸入液氮的導熱柱進行降溫，低溫臺上有小孔用于存放不同樣品，控溫范圍為-190～27 ℃，降溫速率約30 ℃/min，拍攝的圖片分辨率最高可達250 nm。因此，以往的低溫生物顯微鏡系統已實現降溫和觀察兩大基本訴求，且基本以對流型降溫為主。但是對于單項設備，其綜合升降溫速率、極限低溫和成像效果等仍無法滿足諸如人類配子和切片組織的超快速降溫過程研究要求。上述設備對降復溫過程中生物樣品所處的氣體氛圍缺乏相關的考慮和舉措。

本文設計和研制了一種新型低溫生物顯微成像冷凍臺，通過控制裝載生物樣本的環境艙運動，進而與真空絕熱腔體內低溫熱沉的接觸來實現瞬間啟動的快速降溫效果。相較于以往的低溫生物顯微鏡，其生物樣本與低溫冷源分離，既可以實現樣本的環境氛圍可控，還使生物樣本在實驗前的任意時刻都處于常溫狀態，排除降溫初期的干擾和不確定性，并有利于提升降溫速率和提高過程可控性。

1 實驗系統設計與研制

當高速顯微成像需求和深低溫環境兩個要素結合在一起時，所需要實現的技術難度絕不是兩者的線性疊加，其挑戰性成倍增加。在此基礎上，要實現對生物組織切片或者細胞的高速降溫，則又增加了一個技術的維度。為了同步滿足上述多方面的技術要求，設計并搭建了如圖1所示的生物樣品低溫冷凍和顯微成像系統，主要由真空腔體、液氮熱沉、環境艙、氣浮減震平臺、分子泵機組、驅動電機、液氮供排系統和測量控制系統等組成。

圖1 低溫凍融和顯微成像系統

低溫顯微鏡系統與普通顯微鏡相比，其特點在于低溫的實現和對溫度的控制，主要體現在升降溫速率和極限低溫。一方面，為了獲得較高的降溫速率需要樣品與冷源之間具有良好的傳熱能力；另一方面為了達到并保持足夠低的溫度，以及保持視窗不起霧，則需要較強的保溫性能。新型降復溫系統使用電機控制真空環境中物體間的接觸與分離，能很好實現以上兩種傳熱要求。如圖2所示，真空腔體為扁平圓腔，上表面中心設有觀察窗，垂直向下依次設有環境艙和液氮熱沉。

圖2 真空腔體內部設計

環境艙亦為扁平圓盤結構，主體為不銹鋼材質，上蓋板中心為玻璃觀察窗，底面中心開有圓形小孔，內嵌低溫下熱導率極大[12]的藍寶石片并以低溫膠粘接密封形成密閉環境。藍寶石片上表面開有粗細兩條樣品槽以及一個溫度傳感器安裝槽，其結構如圖3所示。環境艙側壁面通過導氣管與外部潔凈氣源連通，其內部氣體氛圍可控，通常處于常壓下，但可更換為空氣、氧氣或氮氣等各種氣體。圖2中液氮熱沉為銅質中空圓筒，容積為2 L，內部充有液氮，頂板焊接三根導熱效率極高的銅柱，向下插入液氮浴中，保持頂面處于液氮溫度。測量控制系統由計算機、溫度傳感器、數據采集儀、測控柜、高速相機、顯微鏡等組成，其中主要設備的性能參數如表1所示。

圖3 藍寶石玻璃載物臺結構

表1 測控系統性能參數

在真空度為10-3Pa的真空腔體中，環境艙與液氮熱沉分離時，兩者之間僅存在極低的輻射換熱，這確保了液氮冷源在待機期間不會影響環境艙。當通過步進電機移動環境艙與液氮熱沉接觸并提供一定預緊力時，兩者之間的傳熱瞬間強化。需要說明的是，藍寶石載物臺的底面相比環境艙的底面微凸0.1 mm，這使得冷量的傳遞集中在載物臺區域，從而實現了核心區域的快速降溫。在樣品復溫時，則使環境艙與液氮冷源處于分離狀態，并啟用加熱絲進行加熱。

2 系統傳熱計算與分析

系統降溫過程中，為了達到更高的降溫速率，必須在減小樣品漏熱的同時，增強從液氮冷源到樣品各個環節間的傳熱。圖4所示為真空腔體傳熱流程。由于藍寶石在低溫下導熱系數極高、可忽略其熱阻。載物臺與液氮熱沉間的接觸熱阻是制約降溫速率的主要因素，同時載物臺的厚度及邊界條件也會對降溫速率產生一定影響。本文將通過對換熱核心區域進行數值模擬以優化設計方案。

圖4 真空腔體傳熱流程

2.1 傳熱計算模型

低溫顯微鏡系統中，關注的核心區域是環境艙內部。由于環境艙為圓盤狀中心對稱結構，故建立以A-A'為對稱軸的二維數值模型，如圖5所示，其中藍寶石載物臺的半徑為r，厚度為δ，溫度傳感器布置點（即監測點）的坐標為（r，0.8δ）。

圖5 環境艙數值模型

假設環境艙外表面為絕熱，環境艙與冷源的輻射換熱忽略不計，溫度傳感器及樣品體積極小，不考慮其對載物片溫度分布的影響。基于以上假設，對所選取區域進行二維非穩態導熱計算。材料物性參數隨溫度變化，特別是藍寶石隨著溫度的降低，其導熱系數會明顯增大，將藍寶石Al2O3的導熱系數k隨溫度T的變化按k=A+B/T來擬合[13]，其中A=-2.599 W/(m·K)，B=11 760 W/m。采用有限差分法將空間和時間離散化，通過空間步長及迭代計算的穩定性條件確定時間步長，根據實驗條件設置溫度場初始條件。對不同邊界條件的每個單元進行能量守恒計算，依次得到后一時刻的溫度場[14]。不同計算區域的傳熱方程不同。

圖6所示為冷源邊界網格。針對坐標（i,j）所在的單元體建立能量平衡式如式(1)。其中Ti，j為對應坐標的單元體溫度，Tc為冷源溫度，hc為冷源與單元體之間的傳熱系數，τ為時間，λ1、ρ和cp分別為單元體的導熱系數、密度和定壓比熱容。

圖6 冷源邊界網格

圖7所示為自然對流區域，針對坐標（i,j）所在的單元體建立能量平衡式如式(2)。其中下標1和2表示不同材質的單元體。

圖7 自然對流區域離散處理

采用格拉曉夫數Gr作為傳熱規律轉變判據[15]，當Gr<104，按導熱計算傳熱量，對流換熱表面傳熱系數h的計算式如下：

當Gr>104，按有限空間自然對流計算，采用如下所示的Nu經驗公式[15]：

Pr為普朗特數，則對流換熱表面傳熱系數h的計算式為：

式中，l為自然對流邊界的幾何尺度。基于上述方法，采用Matlab編寫計算程序。

2.2 數值模擬降溫過程

在液氮熱沉溫度保持80 K恒定、環境艙內為常壓空氣的條件下，利用上述模型計算得到的圖5所示測溫點從室溫開始的降溫曲線如圖8所示，同時給出了利用實驗裝置獲得的實測數據。由圖8可知，實驗數據證明了預測模型的準確性，特別是降溫后期誤差僅在0.5 K以內。

圖8 模擬的降溫過程曲線及實測溫度對比

2.3 載物臺厚度及接觸熱阻對降溫效果的影響

基于上述計算模型，在實驗臺設計初期進行了環境艙溫度場模擬分析，考察載物臺厚度以及液氮熱沉與藍寶石載物臺間不同接觸熱阻對溫降曲線與溫度分布的影響。不同厚度載物臺的溫度監測點降溫曲線如圖9所示。隨著載物臺厚度減薄，樣品的初期降溫速率會有明顯提升，載物片厚度每減薄1 mm，監測點降溫速率提升20 %左右，但對于樣品的極限低溫影響不大。原因是低溫下藍寶石的熱擴散系數明顯高于空氣，隨著藍寶石厚度的減薄，一方面藍寶石法向空間范圍內溫度梯度增大，載物臺上表面更容易受到附近熱空氣的影響，另一方面冷量傳遞到參考點的空間距離縮短，在兩者的共同影響下，參考點總體上呈現降溫速率增加的趨勢。

圖9 不同厚度載物臺時樣品降溫曲線

以3 mm和5 mm兩個載物臺厚度為例，環境艙溫度分布如圖10所示。由圖10可知，兩者在降溫初期（τ=5 s）水平方向上均存在明顯溫度梯度，載物臺四周與中心點的溫差最高可達8 K左右；將樣品放置在載物片的中心位置可在降溫初期獲得較高的降溫速率。

圖10 載物臺溫度分布

根據上述對載物臺的數值模擬結果，考慮到載物臺受力、環境艙密封性能等各方面因素，確定了藍寶石玻璃材質載物臺的具體結構尺寸，其半徑r為10 mm，厚度δ為5 mm。

載物臺與液氮熱沉之間的界面接觸熱阻R對于系統的降溫效果有很大的影響，針對不同接觸熱阻，監測點的降溫曲線如圖11所示。

圖11 液氮熱沉與環境艙間不同接觸熱阻下樣品降溫曲線

接觸熱阻的實驗數據為減小接觸熱阻提供指導。在后續實驗中，將對比研究了環境艙和液氮熱沉間采用不同接觸方式（裸接或填充不同厚度銦箔）時的實際降溫效果。

3 低溫顯微冷凍臺調試

在數值模擬優化的基礎上完成了載物臺、環境艙及真空系統的設計，試制了低溫顯微成像冷凍臺，如圖12所示。

圖12 低溫凍融和顯微成像系統

本文對該系統進行了性能測試。首先將待測樣品放置在環境艙中的藍寶石載物臺上，通過螺絲及氟膠圈將環境艙上蓋板壓緊密封，隨后對整個真空腔體抽真空至10-3Pa量級。再向液氮熱沉內加注液氮，此時環境艙與液氮熱沉處于分離狀態，環境艙溫度所受影響較小。通過嵌入液氮熱沉及藍寶石載物臺的熱電偶溫度計實時監測溫度變化并記錄數據，其過程曲線如圖13所示。

圖13 液氮熱沉加注過程的溫度曲線

液氮熱沉內部存在0.2～0.3 MPa壓力，其對應溫度約86 K，停止注入液氮并調節液氮出口閥門使其逐漸恢復常壓，一段時間后液氮熱沉溫度降至80 K左右（圖14的初始段）。待穩定后，驅動電機使環境艙向下移動直至與液氮熱沉上表面接觸，樣品溫度迅速下降，載物臺及樣品的降溫過程如圖14中40 s之后所示。當載物臺溫度到達極限溫度完成降溫和實驗觀測后，抬起環境艙同時啟動電加熱進行復溫。

圖14 載物臺及樣品的降溫過程溫度曲線

界面接觸熱阻是影響系統降溫效果的決定性因素。界面接觸熱阻是由于固體表面存在粗糙度，界面間不完全接觸形成的[16-17]。特別是處在真空環境時，微觀孔隙中不存在氣體對流，熱阻相比常壓環境更大[18]。系統中采取了在液氮熱沉與藍寶石載物臺之間充墊銦箔來消除/減小界面接觸熱阻。圖15所示的實驗證明，這一舉措大大改善了系統的降溫效果。

圖15 接觸面裸接和使用銦箔墊片時的樣品降溫曲線

采用裸接方式時其降溫速率甚至還不如對流型生物顯微鏡的水平。當采用0.1 mm厚銦箔后，降溫速率顯著提升；當采用更厚的0.2 mm銦箔，樣品降溫速率在0～10 s內達到558 K/min，從室溫298 K降至150 K的平均降溫速率為388.9 K/min，樣品的極限低溫也從裸接方式的240 K降至89 K。在采用銦箔的基礎上，通過增大載物臺與液氮熱沉的預緊，可以進一步減小界面接觸熱阻，達到系統最優的降溫效果，其各溫區的降溫數據如表2所示。

表2 系統各溫區降溫速率數據

4 成像情況檢驗

利用本套低溫顯微鏡系統，拍攝了高降溫速率下人類生精小管細胞（直徑約100 μm）在水、冷凍保護劑（10%二甲基亞颯DMSO）中的冷凍復溫視頻，觀察到了管外水的支狀冰晶形成以及管內細胞液的不同結晶方式[19-21]，如圖16和圖17所示。拍攝視頻分辨率為1 920×1 200，幀率180 FPS，拍攝過程中顯微鏡的放大倍率為200倍，通過氣浮減震平臺以及軟件后期處理解決了高放大倍率下圖像抖動問題，上述成像質量滿足細胞及微小生物組織的低溫冷凍顯微。

圖16 生精小管在水溶液中凍結（降溫速率約為500 K/min）

圖17 生精小管在冷凍保護劑中凍結（降溫速率約為500 K/min）

5 結論

本文提出了一種用于瞬態過程研究的新型低溫生物顯微成像冷凍臺方案，進行了傳熱過程的建模和數值計算，優化了真空絕熱環境艙內的傳熱設計，在此基礎上研制了一套高降溫速率且樣品環境氛圍可控的低溫顯微成像系統，研究了系統降溫特性和極限低溫等，分析了核心換熱區域的傳熱特性，得出如下結論：

1）載物臺與液氮熱沉之間的接觸熱阻對系統的降溫速率起決定性作用，優化接觸方式后系統的降溫速率最高可達1 600 K/min（300～250 K）以上；

2）載物臺厚度以及樣品位置點的選取在降溫初期（300～200 K）對降溫速率產生很大影響，載物臺邊緣與中心的溫差最高可達10 K；

3）樣品極限低溫主要取決于載物臺與液氮熱沉之間的接觸熱阻以及載物臺厚度；

4）獲得了生精小管樣品凍融瞬態過程中管外支狀冰晶形成以及管內細胞液不同結晶方式的高速影像，滿足低溫生物損傷機理研究需求。