聚兩性電解質作冷凍保護劑的應用及進展

牛文雅，占太杰，胥義

（上海理工大學生物系統熱科學研究所，上海 200093）

0 引言

生物樣本庫的建設是推動精準醫療發展的重要基石之一[1-4]，而低溫保存被認為是高質量保存生物樣本的重要措施[5-8]。特別是低溫生物醫學領域自20世紀70年代以來，諸多研究團隊深入研究了生物樣本降溫冷凍、貯藏、復溫以及臨床使用過程中存在的關鍵問題，如凍融過程中冰的形成和生長導致的機械性損傷以及細胞內/外溶質濃度的改變導致的滲透性損傷等[9-10]。在生物樣本低溫保存過程中添加低溫保護劑（Cryoprotective Agent，CPA），可以減少相關損傷，顯著提高樣本存活率，使生物樣本實現高質量的長期保存[11-12]。

根據穿透細胞膜的能力，常用CPA可分為滲透性和非滲透性兩類。滲透性保護劑多為小分子中性物質，如二甲基亞砜（DMSO）[13-15]、乙二醇[16]和甘油等，但這些可快速透過細胞膜的保護劑有一定的基因毒性，會造成細胞的DNA等遺傳物質受到損傷。因此大多需要解凍后立即將其去除[17]；非滲透性保護劑多為小分子糖類或大分子物質，如蔗糖[18-20]、羥乙基淀粉（HES）[21-22]、聚乙烯咯烷酮（PVP）[23-25]和抗凍蛋白（AFPs）[26-27]等，但這類保護劑不能透過細胞膜，可在胞外發揮作用，抑制冰晶生長，誘導胞內脫水，使得胞內濃度提高，實現胞內玻璃化，一般與滲透性保護劑共同使用，可以減輕單一類型CPA對細胞的傷害、顯著提高細胞復溫后的存活率[28]。

近年來，圍繞著低毒性、高效率CPA的開發已成為生物樣本保存的熱點問題之一[29]。2009年，MATSUMURA等[30]首次報道了一種聚兩性電解質羧化聚賴氨酸（COOH-PLL），該物質有較低的細胞毒性和較高的冷凍保存效率，且與各種類型的細胞相容性較好，已經成功實現了紅細胞[31]、人肺癌細胞（A549）[32]、小鼠胚胎[33]等樣本的冷凍保存，展現出了較大的應用前景。但對于聚兩性電解質作為冷凍保護劑的相關作用機制尚在探索中。

本文將介紹聚兩性電解質現有的分類合成方法，闡述其在冷凍保存過程中潛在的低溫保護機制，并討論其作為一種新型CPA在低溫保存中的應用研究進展。

1 聚兩性電解質分類及合成方法

聚兩性電解質也稱兩性聚電解質[34]，是由帶正電和負電的單體亞基組成的聚合物體系。它們既可以是電中性的，也可以是帶有正或負電荷的[35]。這些帶電基團之間的分子間和分子內離子相互作用會影響聚兩性電解質的結構和性質[36]。依據它們在水溶液中對pH變化的響應強弱（弱基團對pH變化的響應更大），聚兩性電解質存在4個亞類[37]（圖1）。已知的天然兩性電解質包括蛋白質和多肽[38]，電荷沿著其組成的一級結構以序列定義的模式分布。但對于人工合成的聚兩性電解質，電荷可以以無序或統計方式分布[39]。現階段聚兩性電解質一般由聚兩性電解質單體組成。而通過兩性離子單體的聚合、引入疏水/親水基團或者聚合后的修飾[40]等多種方法即可制備不同的聚兩性電解質單體（圖2），如：逐步生長聚合（Step-growth）[41-42]、自由基聚合（Free Radical Polymerization，FRP）[43]、可逆失活自由基聚合（Reversible Deactivation Radical Polymerization，RDRP）[44-45]和開環易位聚合（Ring-Opening Metathesis Polymerization，ROMP）[46]等。隨著對各種合成方法的深入研究，可以聚合得到更多結構不同的聚兩性電解質，大大拓展了其在納米醫學[47]、材料科學[48]、催化[49]和海洋應用[50]等方面的推廣和使用。

圖1 聚兩性電解質的4個亞類的代表性結構

圖2 應用各種合成技術聚合成的聚兩性電解質單體

2 聚兩性電解質的冷凍保護機制探索

聚兩性電解質作為一種低毒性的新型CPA，已經成功用于小鼠成纖維細胞L929[51]、不同類型干細胞[52]、血液中紅細胞[53-54]等樣本的低溫保存。而深入探究其在低溫保存過程中的冷凍保護機制，將有助其推廣應用于細胞工程和組織工程等領域。現階段，聚兩性電解質作為CPA的保護機制主要包括冰重結晶抑制活性、與細胞膜的相互作用、在細胞周圍形成緩沖區域3種不同的假說。

2.1 冰重結晶抑制活性假說

細胞冷凍保存后復溫的過程中，冰晶的再生長會導致膜破裂和脫水，從而導致細胞死亡[55]。有研究表明可以利用冰重結晶抑制劑來控制該過程。如自然界廣泛存在的、具有較高熱滯活性、能改變冰晶生長特性和抑制冰晶重結晶的蛋白質，即抗凍（糖）蛋白（AF(G)Ps）[56-57]。受AF(G)Ps啟發[58]，MITCHELL等[59]在2014年首次對聚兩性電解質的冰重結晶抑制（IRI）活性進行定量研究。通過對聚甲基丙烯酸氨基乙酯后聚合改性、然后與琥珀酸酐反應生成聚兩性電解質，結果顯示出較強的IRI活性，可以很大程度上降低細胞等樣本在復溫過程中冰重結晶風險。為了直觀了解聚兩性電解質的IRI活性，STUBB等[60]對比了聚兩性電解質與PBS緩沖劑在顯微鏡下的冰晶尺寸。結果顯示聚兩性電解質的平均晶粒尺寸更小，顯示出在抑制冰晶生長方面有較好的作用。盡管如此，聚兩性電解質的IRI活性仍小于AF(G)Ps，說明冰重結晶活性可能并不是聚兩性電解質冷凍保護機制的主要原因，但利用AF(G)Ps的結構進行新型聚兩性電解質的合成，可能提高其冰重結晶抑制活性，從而實現更高效率的樣本保存。

2.2 與細胞膜的相互作用假說

盡管IRI活性是決定整個凍存體系防凍能力的重要參數之一，但在保存生物樣本時，聚兩性電解質如何與生物樣本相互作用可能更加關鍵。有研究發現，當細胞在聚兩性電解質溶液中冷凍時，聚兩性電解質分子會附著在細胞膜上[62]，維持膜結構的穩定性，并且這種作用隨著聚合物濃度的增加以及疏水性基團的引入而增強[63]，如圖3所示。

圖3 聚兩性電解質與細胞膜相互作用[63]

CROWE等[64]發現海藻糖或蔗糖等物質可以穩定細胞膜結構，降低其從凝膠態到液晶態的相變溫度。RAJAN等[63]研究了聚兩性電解質與細胞的相互作用，利用差示掃描量熱儀（Differential Scanning Calorimeter，DSC）獲得聚兩性電解質存在時脂質的熱譜圖，發現聚兩性電解質同樣也可以降低了磷脂膜的雙層凝膠-液晶的轉變溫度，并且隨著聚兩性電解質濃度的增加，轉變溫度下降的越明顯。為了進一步證明其與膜的相互作用方式，采用電子自旋共振（Electron Spin-resonance Spectroscopy，ESR）光譜，通過探針對膜磷脂雙分子層進行旋轉標記，研究聚兩性電解質對膜極性區域的影響，發現具有明顯冷凍保護特性的聚兩性電解質會與膜的外表面相互作用，這種相互作用可以保護膜免受各種冷凍誘導的破壞。據此，這種與細胞膜的強烈相互作用被諸多研究者看作聚兩性電解質冷凍保護機制一個重要組成部分。

2.3 細胞周圍形成緩沖區域假說

除了冰重結晶抑制活性、膜保護機制外，還有一種觀點認為：聚兩性電解質在細胞周圍形成富含聚合物的液相，在細胞周圍提供無冰的局部環境，并促進細胞脫水以抑制細胞內的冰晶[65]。解凍過程中，聚合物的液相區域融化速度快，細胞被濃縮的聚合物溶液包圍覆蓋，從而在細胞和剩余的冰之間形成了一個緩沖區，這個緩沖區可以減小重結晶帶來的細胞損傷（圖4）。因此，這種作用機制可能賦予了聚兩性電解質高效的冷凍保存效率。

圖4 細胞周圍形成緩沖區域[65]

3 聚兩性電解質冷凍保護劑的應用

聚兩性電解質具有補充或替代DMSO和其他冷凍保護劑（例如非滲透性CPA）的潛力。前期關于聚兩性電解質在冷凍保存方面的工作都集中于琥珀酸酐改性的羧化聚賴氨酸[30]（COOH-PLL），因其優良的低溫保存特性，逐漸吸引了更多的研究人員開發了一系列的聚兩性電解質用作CPA，將它們單獨使用或與其他CPA結合使用時都能提高樣本的存活效率，如表1所示。

表1 其它聚兩性電解質作為冷凍保護劑

3.1 聚兩性電解質在冷凍保存中的應用

3.1.1 第一種用作保護劑的聚兩性電解質

2009年，MATSUMURA等[30]首次發現在保存L929細胞時，通過合成COOH-PLL（制備路線如圖5所示）用作CPA可以實現良好的保存效果，且表現出比DMSO更高的冷凍保存效率和更低的細胞毒性。進一步研究發現，COOH-PLL的保護效果與其正負基團比例相關（如表2），當其正負基團擁有適量比例且羧基略多時IRI活性最高，冷凍保存效果最好，這說明聚兩性電解質的結構對保護效果至關重要。另有文獻[62]證明COOH-PLL不會影響細胞的表型特征和后續增殖能力，細胞在-80 ℃冰箱凍存24個月，解凍后仍能保持其良好的存活和增殖能力。對于部分哺乳動物細胞的冷凍保存，如牛卵丘細胞[66]、人真皮成纖維細胞等[67]，選用COOH-PLL作為單一型CPA可實現其低溫保存。

圖5 羧化聚賴氨酸（COOH-PLL）制備路線[30]

表2 使用不同羧基/氨基比例的COOH-PLL保存，解凍后的L929細胞活力

而對于豬胚胎、胰島等大型樣本的低溫保存，COOH-PLL單一型CPA效果并不理想。若此時將COOH-PLL與其他CPA（乙二醇、甘油和葡聚糖等）結合使用，保存效率則會有明顯的提升。表3所示為COOH-PLL單一使用或與其他CPA結合使用時保存各類細胞的研究進展。

表3 COOH-PLL作為冷凍保護劑

1.3.2 其余物質為前體的聚兩性電解質

COOH-PLL展現了出色的保護效果，但制備COOH-PLL所需的前體聚賴氨酸較為昂貴。于是MITCHELL等[54]利用一種低成本的共聚物，即馬來酸酐作為前體，通過自由基聚合反應生成1∶1正負電荷比的聚兩性電解質。并且證明這種聚兩性電解質顯示出特定的IRI活性，與羥乙基淀粉共同使用時可以顯著提高冷凍保存后紅細胞的存活率。通過自由基聚合反應合成的聚兩性電解質高效且成本低廉，但無法控制聚合物的分子量及其分散性。BALLEY等[53]同樣基于馬來酸酐共聚物為前體開發了一種的新型區域規則性的聚合物，這種聚兩性電解質與DMSO相比，不僅可以使解凍后的A549細胞存活率達89%以上，而且還可以使更弱的細胞系，如小鼠腦神經母細胞瘤細胞（Neuro-2a）和小鼠顱骨成骨細胞（MC-3T3）存活率提高三倍。另外，ZHAO等[65]合成以丙烯酰胺基為前體合成的三元聚兩性電解質（PDA30與PDA45），材料同樣易得、且水解穩定，合成步驟簡單。但這種新型的保護劑顯示出分子結構和分子量的依賴性，僅當分子量為49 kDa的PDA30表現出與10%DMSO相近的低溫保護效果。然而，僅使用丙烯酰胺基為前體的聚兩性電解質作為CPA保存后的細胞，經過24 h后存活率會略微降低。但若是將2%的DMSO加入到10%丙烯酰胺基為前體的聚兩性電解質中，可顯著改善細胞存活率。

RAJAN等[61]利用可逆加成-斷裂鏈轉移聚合（RAFT）的方式，以甲基丙烯酸（MAA）和甲基丙烯酸-2-(二甲氨基)乙酯（DMAEMA）為前體合成了一種聚兩性電解質。這種新型的聚兩性電解質可以將凍融后L929細胞的存活率提高到90%以上。與此同時，少量疏水性基團的引入可以顯著提高它們的低溫保護性能。其中可能的原因是疏水度的增加導致冰晶尺寸減小[64]。但引入疏水性基團增加低溫保存效率不是通用的。ZHAO等[65]將疏水性基團結合到聚兩性電解質中，期望進一步提高細胞存活率。但是發現隨著疏水性基團濃度增加細胞存活率反而下降?？赡艿脑蚴蔷蹆尚噪娊赓|在較高的疏水含量下，聚合物鏈的溶劑化減弱導致結構塌陷。其中大部分疏水基團都在塌縮的螺旋內，無法發揮作用。從而導致對冰晶的抑制作用較弱。因此疏水性基團的引入如何改善聚兩性電解質的冷凍保護活性仍需要進一步研究。

通過不同前體物質的探索，應用到不同生物樣本中，聚兩性電解質作為CPA表現出良好的低溫保存效果，盡管部分聚兩性電解質暫時不能完全代替DMSO作為冷凍保護劑，但是通過與其他類型的CPA聯合使用，有望實現傳統含DMSO型保護劑替代使用。

3.2 聚兩性電解質CPA的新型使用方法

傳統聚兩性電解質作為CPA使用時，通過直接溶解在水溶液中制得CPA溶液體系，再加載到生物樣本中進行低溫保存，但是通過化學合成方法，利用聚兩性電解質內部帶電荷的官能團之間的離子交聯形成的聚兩性電解質水凝膠，表現出良好的生物相容性[72]與多功能性，且在控制藥物釋放、調控降解過程以及定標靶向位置等方面顯示出較大的應用價值[73]。

聚兩性電解質水凝膠也可作為低溫保存載體，用于細胞生物樣品的低溫保存。2013年，JAIN等[74]利用點擊化學法開發出一種基于葡聚糖的聚兩性離子水凝膠（圖6），用于在冷凍保存之前封裝細胞形成構建體。這種基于葡聚糖的聚兩性電解質水凝膠可將L929細胞存活率提高到90%，并且無需同時加載其他CPA。但這種水凝膠只對懸浮細胞顯現出良好的保護效果，在保存單層細胞或者厚度較大的樣品時效果不佳。除了利用點擊化學法制備的聚兩性電解質水凝膠，JAIN等[75]利用聚兩性電解質與鋰皂石之間相互作用，將解凍后載有聚兩性電解質的細胞與適量的皂石混合形成智能水凝膠，用于特定部位的細胞遞送和組織修復。細胞在這種水凝膠系統中凍融后仍能存活，使用時無需洗脫CPA。因此有希望使其成為長期儲存系統和合適的現成組織工程產品。

圖6 聚兩性電解質水凝膠用于細胞包封和冷凍保存[74]

聚兩性電解質水凝膠在生物醫學應用中有巨大潛力[76]。盡管聚兩性電解質水凝膠在CPA中的應用較少，但未來可研究該系統是否可以應用于更復雜的細胞或組織中、或者通過與其他相關技術手段相結合，進一步發揮其在低溫保存應用中的價值。

4 結論

本文介紹了聚兩性電解質的結構多樣性、分析了聚兩性電解質作冷凍保護劑的保護機制，整理了當前不同聚兩性電解質冷凍保護劑的保存效率，得出如下結論：

1）新型聚兩性電解質保護劑，具有高效、低毒的顯著優勢；

2）聚兩性電解質的保存效率與其分子量、正負基團比例、疏水性基團濃度密切相關；

3）聚兩性電解質優化使用后可將生物樣本存活率提高至90%以上；聚兩性電解質制備成低溫保存水凝膠具有更加廣泛的應用前景；

4）在未來，需要更加深入研究聚兩性電解質的冷凍保護機制，探索聚兩性電解質是否可用于保存更復雜的對象，并開發毒性更低、價格更低廉和更易于合成的聚兩性電解質用作CPA，為聚兩性電解質的新式應用提供更多的可能性。