可吸收止血材料的體外抑菌和止血效果評價

張爽，葉紅，童琳，曹琛，徐慶華

安徽省醫學科學研究院 預防醫學研究所，安徽 合肥 230061

引言

在通過壓力、結扎和其他常規止血技術無法止血的情況下，可吸收止血材料可放置于手術部位輔助止血，并可在人體內被降解吸收，目前已廣泛應用于外科手術中[1-3]。目前已獲批的可吸收止血材料包括氧化纖維素、膠原蛋白/明膠、殼聚糖、纖維蛋白原以及淀粉[4-5]。止血材料的選擇取決于傷口類型及預期用途。例如，片狀紗布類止血材料能夠加壓使用，因此適用于多種類型的傷口，包括出血嚴重的情況；粉末和凝膠狀的止血材料容易因出血嚴重而無法保持附著在傷口處，因此適合覆蓋表面不規則或出血相對輕微的傷口[6]。其中，纖維素類止血材料在市場中的使用占比最高[7]，這類產品在室溫下存放即可，易于快速打開包裝并放置于出血部位，且止血后產品易移除，便于醫護人員在術中保持無菌操作[8]。

但臨床實際應用中發現可吸收止血材料存在止血效果差異和潛在感染風險。因此，有必要對止血材料的抑菌和止血效果建立統一的評價標準，以便尋找到止血效果更好同時具備一定抑菌性的止血材料。此外，了解止血材料的作用機制、功效以及可能發生的不良事件，對于外科醫生在手術中選擇最合適的止血材料具有重要的意義。

可吸收止血材料的相關評價標準及參考內容目前僅有2016年國家食品藥品監督管理總局頒布的《可吸收止血產品注冊技術審查指導原則》[9-10]，以及2021年國家衛生健康委醫院管理研究所醫用耗材評估與管理項目組發表的《醫療機構止血材料管理專家共識》[11]。為此，本實驗室開展了本次對可吸收止血材料體外抑菌和止血效果評價的實驗，選取市售常用的不同材質、不同形態的可吸收止血材料，對其抑菌性以及體外凝血效果進行評價。同時，本研究中使用的簡單、快速、可靠的實驗方法，也可為建立可吸收止血材料評價體系以及行業標準提供部分實驗依據。

1 材料與方法

1.1 止血材料

本實驗共選取9款市售的常用止血材料。根據國家醫保醫用耗材分類與代碼目錄，本實驗選取的止血材料按形態可分為紗布（A-E類）、非織布（F-H類）和纖絲（I類）；同形態下按材質可分為再生氧化纖維素（Oxidized Regenerated Cellulose，ORC；A類、B類、H類和I類）、羧甲基纖維素（Carboxymethyl Cellulose，CMC；C類、E類和F類）、羥乙基纖維素（Hydroxyethyl Cellulose，HEC；D類）和殼聚糖（Chitosan，CTS；G類）[11]。

1.2 體外抑菌實驗

抑菌實驗采用的方法為《WS/T 650-2019抗菌和抑菌效果評價方法》[12]中規定的抑菌環法。無菌環境下，將9款止血材料制成直徑為5 mm、厚度不超過4 mm的圓片，每組包含4片試驗樣片。另取濾紙片制成與試驗組尺寸相同的圓片，作為陰性對照樣片。

實驗采用的菌株為金黃色葡萄球菌ATCC6538、大腸桿菌8099和銅綠假單胞菌ATCC15442的凍干株，傳代培養，接種于營養瓊脂斜面上，37 ℃條件下培養24 h。用磷酸鹽緩沖液洗滌營養瓊脂新鮮斜面培養物，并稀釋至5.0×105～5.0×106cfu/mL。用無菌棉拭子蘸取試驗菌液，均勻涂抹于營養瓊脂培養基平板的表面。每次涂抹后，將平板轉動60°，再次涂抹，共重復3次，最后將棉拭子繞平板邊緣再涂抹一周。蓋好平皿，室溫下放置干燥5 min。

用無菌鑷子將樣片緊貼于干燥后的平板上，并輕壓。每次試驗貼放1個染菌平板，每個平板在中心位置貼放1片陰性對照樣片，四周貼放4片試驗樣片。每個樣片中心點相距＞25 mm，與平板邊緣相距＞15 mm。操作完成后蓋上平板，放置于37 ℃的生化培養箱中培養18 h，觀察有無抑菌環形成。用游標卡尺測量抑菌環的外沿直徑并記錄數據。抑菌環直徑＞7 mm表示有抑菌作用。每次測量4片試驗樣片產生的抑菌環直徑，重復3次，計算12次測量結果的均值[13]。

1.3 體外倒置凝血實驗

將9款止血材料和對照組普通紗布分別處理為2 cm ×2 cm的正方形樣品，用鑷子夾取放置于無菌培養皿中，將培養皿放入生化培養箱中于37 ℃下保溫5 min待用。

用移液槍向待測樣品表面滴加400 μL 37 ℃預熱抗凝豬血，充分浸潤待測樣品，隨后用移液槍在每個樣品上滴加45 μL 0.2 mol/L的CaCl2溶液，均勻混合[14]。將滴加了血液的樣品放置于37℃培養箱中反應5 min，觀察樣品凝血程度的差別。取出樣品后，翻轉培養皿，觀察凝血情況。

1.4 體外動態凝血實驗

將9款止血材料和對照組普通紗布分別處理為1 cm ×1 cm的正方形樣品，用鑷子夾取放置于無菌培養皿中，將培養皿放入生化培養箱中于37 ℃下保溫5 min待用。

取出待用的培養皿，用移液槍向待測樣品表面滴加200 μL 37 ℃預熱抗凝豬血，充分浸潤待測樣品，隨后用移液槍滴加25 μL 0.2 mol/L的CaCl2溶液，均勻混合。分別將培養皿放入氣浴恒溫振蕩器中以37 ℃、30 r/min的條件充分振蕩1、5、10 min，加入20 mL超純水終止反應，繼續在80 r/min的條件下充分振蕩，淋洗出未被止血紗布凝結的紅細胞。收集淋洗液后放置于離心機中，以300 r/min離心5 min。離心結束后，采用紫外可見分光光度計測量試驗樣品淋洗液、普通紗布淋洗液（陰性對照組）以及抗凝豬血溶液（空白組）在540 nm下的吸光度。計算體外凝血指數（Blood Clotting Index，BCI）：BCI（%）＝樣品吸光度/空白組吸光度×100%。重復3次，取平均值作為最終的BCI測定值。BCI值越低，表明止血材料的凝血效果越好，反之則說明凝血效果越差[15]。

1.5 統計學分析

2 結果

2.1 體外抑菌實驗

采用大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌進行體外抑菌實驗，得出的結果一致：A、B、H和I類樣品均出現抑菌環，且直徑均＞7 mm，而C、D、E、F、G類樣品均無抑菌環產生（圖1～3）。此結果表明，A、B、H和I類止血材料對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌都有抑菌作用；而C、D、E、F和G類止血材料對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌均無抑菌作用。重復上述實驗3次，結果相同。游標卡尺測得的抑菌環直徑如表1所示。

表1 不同種類可吸收止血材料產生的抑菌環直徑（n=12，mm）

圖1 不同種類可吸收止血材料對金黃色葡萄球菌的體外抑菌效果

圖2 不同種類可吸收止血材料對大腸桿菌的體外抑菌效果

圖3 不同種類可吸收止血材料對銅綠假單胞菌的體外抑菌效果

2.2 體外倒置凝血實驗

如圖4所示，37 ℃反應5 min后，A、B、G、H和I類材料上的血樣已開始凝聚，出現明顯的血液凝結現象，其中B、H和I類材料上的血液呈棕黑色，說明凝血效果最好，其次是A和G類材料。C、D、E和F類材料的血液凝結效果較差，而陰性對照組幾乎無凝血效果。整體而言，不同形態的止血材料中，纖絲類和非織布類材料的凝血現象較紗布類更顯著；紗布類材料中，ORC材質的凝血現象較CMC和HEC材質更顯著。

圖4 體外倒置凝血效果圖

2.3 體外動態凝血實驗

各時間段，9款止血材料及陰性對照組的BCI存在顯著差異（P＜0.001）。1 min 和5 min時，9款止血材料的BCI均低于陰性對照組，差異具有統計學意義（P＜0.05）；10 min時，9款止血材料的BCI也均低于陰性對照組，但D、E和F類材料與陰性對照組的差異未顯示出統計學意義（表 2）。

表2 不同種類可吸收止血材料BCI（±s，%）

表2 不同種類可吸收止血材料BCI（±s，%）

注：與A類比較，aP＜0.05；與B類比較，bP＜0.05；與C類比較，cP＜0.05；與D類比較，dP＜0.05；與E類比較，eP＜0.05；與F類比較，fP＜0.05；與G類比較，gP＜0.05；與H類比較，hP＜0.05；與I類比較，iP＜0.05。

BCI 1 min 5 min 10 min A類 (紗布，ORC) 66.49±8.36 59.71±6.10 54.28±3.98 B類 (紗布，ORC) 39.24±1.07a 33.37±5.37a 28.30±8.21a C類 (紗布，CMC) 79.39±1.26ab 72.30±4.08ab 61.71±3.62b D類 (紗布，HEC) 80.15±5.27ab 74.23±2.49ab 67.06±4.40ab E類 (紗布，CMC) 81.08±3.62ab 76.01±3.09ab 71.29±0.96ab F類 (非織布，CMC) 82.35±3.64ab 73.86±5.67ab 66.81±11.06ab G類 (非織布，CTS) 71.34±5.14bef 62.83±4.37bcdef 55.47±3.76be H類 (非織布，ORC) 16.00±10.72abcdefg 7.13±1.59abcdefg 8.91±6.57abcdefg I類 (纖絲，ORC) 3.57±1.40abcdefgh 4.50±2.36abcdefg 4.05±2.15abcdefg陰性對照 93.73±0.80abcdefghi 90.52±2.26abcdefghi 76.48±15.08abcghi F值 105.55 166.21 39.01 P值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001分組

不同形態止血材料的BCI存在差異。纖絲類材料1、5 和10 min時的BCI均顯著低于紗布類和非織布類材料（P＜0.05），且非織布類和纖絲類材料1、5和10 min時的BCI均顯著低于陰性對照組（P＜0.05）。相同形態下，不同材質止血材料的BCI也存在顯著差異。紗布類材料中，1、5 和10 min時，ORC材質（A和B類）的BCI均顯著低于CMC材質（C和E類）以及HEC材質（D類）（P＜0.05），而CMC與HEC材質的BCI無統計學差異。非織布類材料中，1、5 和10 min時，ORC材質（H類）的BCI均顯著低于CMC材質（F類）及CTS材質（G類）（P＜0.05）；CTS材質5 min時的BCI顯著低于CMC材質（P＜0.05），1 min和10 min時兩組差異無統計學意義（表3）。綜上，相同形態下，ORC材質的BCI低于其他材質的止血材料。

表3 不同種類可吸收止血材料BCI（±s，%）

表3 不同種類可吸收止血材料BCI（±s，%）

注：紗布中，與ORC比較，aP＜0.05；非織布中，與ORC比較bP＜0.05，與CMC比較，cP＜0.05；與紗布比較，dP＜0.05；與非織布比較，eP＜0.05；與纖絲比較，fP＜0.05。

ORC (H) 16.00±10.72 7.13±1.59 8.91±6.57 CMC (F) 82.35±3.64b 73.86±5.67b 66.81±11.06b CTS (G) 71.34±5.14b 62.83±4.37bc 55.47±3.76b均值 56.56±31.42 47.94±31.20 43.73±27.40 F值 73.635 213.944 47.149 P值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001纖絲 ORC (I) 3.57±1.40de 4.50±2.36de 4.05±2.15de陰性對照 陰性對照 93.73±0.80ef 90.52±2.26ef 76.48±15.08ef F值 10.391 9.440 8.025 P值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001形態分類 材質 (類別)BCI 1 min 5 min 10 min紗布ORC (A、B) 52.87±15.84 46.54±15.32 41.29±15.35 CMC (C、E) 80.23±2.59a 74.16±3.82a 66.50±5.76a HEC (D) 80.15±5.27a 74.23±2.49a 67.06±4.40a均值 69.27±16.98 63.12±16.92 56.53±16.27 F值 12.010 13.111 10.078 P值 ＜0.001 ＜0.001 0.003非織布

3 討論

ORC是一種植物性止血劑，結構編織較為松散且具有良好的柔韌性[16]。CMC是一種合成聚合物，易溶于水，具有較強的吸收和運輸液體的能力[17]。HEC是一種合成聚合物，易溶于水、成膜性好，具有良好的穩定性[18]。CTS是一種線性多糖，無毒、親水、易于改性，可在人體內降解為易吸收的氨基糖[19]。這四類都是常見的止血材料的材質。

抑菌實驗結果顯示，ORC材質的止血材料具有抑菌性，而CMC、HEC和CTS材質的材料未表現出抑菌效果。可能的原因有ORC材質可形成弱酸性環境，從而對革蘭陽性、革蘭陰性和部分抗生素呈耐藥性的細菌產生抑制作用[16,20-21]。

倒置凝血實驗顯示，不同形態的止血材料中，纖絲類和非織布類材料較紗布類能更快速出現血液凝結現象；動態凝血實驗則表明纖絲類的止血效果優于非織布和紗布類材料，可能因為纖絲和非織布類材料具有更緊密的纖維結構，與血液的接觸面積更大，從而表現出更優異的止血性能。此外，相同形態下，無論是紗布類還是非織布類材料中，ORC材質的止血效果均優于其他材質。ORC材質被血液飽和后，會膨脹成褐色或黑色的凝膠狀物質，有助于形成凝塊，同時可壓迫創面血管，從而迅速發揮局部止血作用[5,22]。

臨床中具體使用何種止血材料取決于出血的類型、材料的特定作用機制、與環境的相互作用以及患者個體的凝血功能差異。理想的止血材料應具有易使用、有效性、無抗原性、可完全吸收且價格經濟的特點[10]。新型材料的發現以及傳統工藝的改良，將為臨床醫生及患者提供更多、更優異的止血材料選擇。建立可吸收止血材料的評價體系，對不同產品的各項性能進行評價，有利于臨床醫生對材料進行選擇以及止血材料生產廠家對產品質量進行把控與監督[23]。

當然，本實驗存在一定的局限性。臨床上選擇何種形態的止血材料，與應用場景有關。本研究只涉及體外實驗，若要分析不同形態的材料在實際應用時的止血效果差異，還需要進一步的體外凝血實驗及體內實驗來驗證方法的可靠性和可重復性[24-25]。此外，需要對不同材質、不同形態的止血材料進行更加全面的評價，以完善可吸收止血材料的抑菌和止血效果評價體系。

4 結論

本研究顯示不同材質、不同形態材料的止血和抑菌效果都存在差異。不同材質的材料中，ORC類具有抑菌效果。纖絲類材料的止血效果優于非織布類和紗布類；非織布類和紗布類材料中，不同材質材料的止血效果差異性顯著，ORC材質的止血效果優于CMC、HEC和CTS材質。新形態的止血材料具有獨特的優勢，如纖絲能分層塑性，而非織布具有良好的支撐性，是多種適用場景（如腔鏡手術）的優先選擇。本研究使用的實驗方法可為建立可吸收止血材料評價體系以及行業標準提供一定的基礎。