SNP微陣列和基因捕獲測序聯合在智力障礙或精神發育遲緩兒童中的應用價值

季芳

南京醫科大學附屬兒童醫院 康復科，江蘇 南京 210008

引言

據不完全統計，我國智力障礙新生兒發生率為0.43%～0.96%，該病多發生在兒童時期5歲以下，表現為智力低下或生長發育緩慢，其致病原因復雜，遺傳不規則性較大。目前該病超過一半的臨床人群不能被明確地診斷出病因。本研究選取19例原因不明的智力障礙或發育遲緩的患兒，通過單核苷酸多態性（Single Nucleotide Polymorphism，SNP）微陣列技術和新一代基因捕獲測序技術先后對全基因組拷貝數變異（Copy Number Variation，CNV）和發病基因變異進行檢測，以期了解流行病學相關的造成兒童智力障礙和精神發育遲緩的遺傳性病因不明的潛在影響因子，該技術成果若能應用于診斷和遺傳咨詢服務中，可減少產前診斷二次篩查的次數，對優生計劃來說十分重要，尤其是對原發性病因研究方面意義重大[1-2]。

1 材料與方法

1.1 一般資料

通過資料分析法對2018年9月至2020年3月在南京醫科大學附屬兒童醫院康復門診接受治療的非明確性病因所造成的智力障礙或精神發育遲緩患兒19人[3-5]，分別采用發育診斷量表和韋氏兒童智力量表中國修訂本（WISCRC）對其進行智力評定，病史采集與分析流程如圖1所示。本研究得到患兒家屬認可并簽署知情同意書，并通過院方倫理委員會的審核批準（201907238-1）。

圖1 病史采集與分析流程圖

納入標準：① 年齡6個月至14歲；② 發育評分低于49分或智商低于51分；③ 無遺傳性疾病和遺傳代謝病。

排除標準：① 存在孕期不良因素；② 有圍生期損傷史；③ 有生后腦損傷史。

1.2 方法

在受試者同意的情況下，取患兒靜脈血5 mL，并相應抽取其父母靜脈血5 mL。操作流程：首先，做SNP微陣列檢測，若有異常標本用實時定量聚合酶鏈反應（Polymerase Chain Reaction，PCR）檢測芯片進一步處理，并確定其親本的對應點；若無異常則進行標準的基因捕獲測序檢測，通過Sanger測序查找突變點，同時也相應測試其親本的對應位點[6]。

1.2.1 SNP微陣列技術

選用HumanCytoSNP-12 Bead Chip Kits（美國Illumina公司）芯片（內有30萬個檢查的位點）進行檢測，取患兒基因組DNA 200 ng與4 μL NaOH溶液混合，在室溫狀態下靜置10 min再繼續DNA變性操作，交替加入68 μL馬赫稀釋試劑和75 μL標準核膜基液將DNA進行復性處理，放入雜交爐37 ℃環境下靜置20 h；之后加入50 μL段化性測試基液在37 ℃狀態下等待1 h再繼續進行DNA片段化處理，稍后注入100 μL博飛美科緩沖溶液和300 μL的C3H8O，在4 ℃下以14000 r/min離心處理并收集DNA沉淀；然后溶入46 μL的人參皂苷試劑，在48 ℃的環境下靜置1 h后再次懸置片段化處理DNA，注意將得到的DNA溶液置入芯片后放入密封的雜交箱中，并在48 ℃下繼續雜交16 h。除掉薄層后，用細胞內二硫化物還原劑（Protected Borane Tcep，PB1）溶液清洗掉片上的非交叉性和非特異性雜交的DNA片段，啟動單堿基擴增來擴增芯片上的DNA片段。在芯片清洗過程中，從PB1清洗液中除去擴展的多余反應液，繼續用包被試劑浸漬芯片，再采用負壓干燥，接著使用Isean Rapid System繼續采集，后經KaryoStudio 軟件模塊進行分析[7]。該項技術手段較傳統SNP檢測法（凝膠電泳進行檢測）有更快速、高效、自動化的特點，且針對問題DNA鏈的二級結構不易產生人工假象，獲得的結果可信度高。

1.2.2 新一代基因捕獲測序技術

采用最新德國肖特（SCHOTT）NEXTERION?Slide AL型號的基因芯片進行測定，步驟如下：① 針對智力障礙或基因缺陷而引起的生長遲緩問題，本研究設計了1016個基因探針，這些探針目前已被識別或被報道可能與智力障礙或精神發育遲緩有關，本次使用的探針由美國AngelenTech公司提供，能有效地覆蓋上述及鄰近的所有外基因區域，其中含有亞區域50 bp[8]；② 第二代高通量序列：針對智力障礙或發育遲緩基因檢測應用SNP微陣列和二代基因捕獲測序技術聯合的技術方法。基因組DNA獲取自外胚層血液，基因組DNA隨機中斷為250～300 bp的片段，并進行細節修復、連接密封。其經連接介導（Ligation-Mediated，LM）-PCR放大、凈化，取得DNA文庫，并進行文庫的質量檢驗。接著將LM-PCR產物與捕獲芯片進行探針雜交、攝取、包裝和洗滌，運用定量PCR檢測富集效率[9]。使用Illumina Hiseq 2500高通量測序儀器進行測序，測序長度為2×150 bp；③ 進行必要的DNA生物信息辨證與突變驗證：經序列儀獲得原始序列再結合SoftGenetics GeneMarker 3.0.0美國版基因分析軟件，通過現有的UCSC數據庫比對人類基因組提供的HG19參考序列，并評估目標區域的序列覆蓋率和質量，這要求每個樣本的平均序列深度超過100倍，靶區覆蓋率超過99%[10]。利用HGMD基因突變數據庫、人類基因組數據庫和DHSNP數據庫信息對檢測到的變異位點進行評價，以識別基因、坐標、RNA位點和氨基酸變化，再結合SIFT和PPLYS2等軟件預測單個核苷酸變化對功能蛋白的影響。最后，研究與疾病相關的候選基因的突變點，然后進行Sanger測序和親代染色體DNA分析。新一代基因捕獲測序技術有如下優點：① 高通量；② 高效測序形式；③ 更長讀取區域；④ 結果精準并可測出極小的變異相；⑤ 低起始量；⑥ 低成本。

2 結果

2.1 一般情況比較分析

本研究選取的19名智力障礙或精神發育遲緩患兒，其年齡在6個月至14歲，其中男童11人和女童8人，對0～4歲患兒采用發育診斷量表和對所有患兒采用韋氏兒童智力量表中國修訂本（WISC-RC ）評定，結果如表1所示。其中發育商低于40分或智商值低于51分者均表現出不同程度的智力低下問題或發育不良，且為先天性、靜止性病程，其體檢中血液、尿代謝檢測和生物化學等指標表現正常，家族史中也沒有智力障礙現象。

表1 19例患兒的發育診斷量表和韋氏兒童智力量表中國修訂本（WISC-RC ）評定結果

2.2 SNP微陣列、新一代基因測序診斷指標及實時PCR芯片驗證

19例患兒中，發育不良可疑性病例2的SNP微陣列分析顯示21q22.2q22.3區間內存在基因微缺失，如圖2所示，其紅色處為發現的CNV，對應的箭頭標示為區域缺失段；由表2聯合診斷結果可知，3名患兒臨床表現均有發育遲緩體態，且伴有SNP微陣列區位缺失，遺傳模式N/A，屬新生致病性變異。病例2的檢測結果是染色體21號q22.2q22.3區發生了6.1 Mb缺陷，選擇PCNT及DSCAM 的Gene E47和E2 外顯子使用實時PCR技術檢查芯片結果，2-ΔΔct值為0.31、0.35，父親2-ΔΔct值為0.74、0.67，母親2-ΔΔct值為0.62、0.82，證明所檢測的主體PCNT及DSCAM 的Gene E47和E2外顯子出現雜合缺陷，而父母是正常的（通常情況下2-ΔΔct＜0.6即代表雜合缺失現象)[11]。

圖2 發育遲緩病例2的SNP微陣列分析顯示21q22.2q22.3區域缺失

2.3 基因變異與智力障礙或精神發育遲緩關聯性

經數據庫查詢發現以上變異與智力障礙或精神發育遲緩相關，得出的分析結果如表2所示。研究結果顯示19名參與者中有16名患兒的SNP微陣列分析結果為陰性，確認了6例患有單一遺傳疾病的兒童病例（4例新生兒突變、2例存在復合雜合子突變，突變來自正常父母表型）；患兒例7表現為發育遲緩，同時伴有先天性心臟病和精神錯亂的疼痛，經檢查發現為切割部位斑點復合雜合子突變，圖3為該先天性多發異常-肌張力衰減-癲癇綜合征I型疾病患者的基因突變驗證及父母測序結果。這是一種復合型突變，包括切割點Pig N Gene c.1172+1G＞C和c.1434+5G＞A復合突變。其中c.1172+1G＞C是一個共同的剪切點突變，而c.1434+5G＞A則是一個很有可能的剪切點突變，軟件預測提示該突變可能影響剪切。另有3個病例存在可疑的基因突變情況（1例為新生兒缺陷移碼突變、2例為表型正常的父親移碼突變所致）[12-15]。

圖3 患兒例7（陰性及有先天性心臟病及癲癇I型綜合征）的基因突變驗證及父母測序

表2 19名患兒的SNP微陣列和新一代基因捕獲測序技術聯合診斷結果

3 討論

隨著醫療設備及醫學技術的高速發展，基因捕獲測序技術也不斷發展，其中第三代基因捕獲測序技術的誕生，將以SNP微陣列和新一代基因捕獲測序技術為代表的大規模測序正式推入新時代。SNP微陣列和新一代基因捕獲測序技術聯合屬于更高通量測序技術，其比傳統的基因捕獲測序檢測更具優越性[16]。SNP微陣列聯合新一代基因捕獲測序技術可同時進行幾百萬甚至幾千萬條DNA序列的檢測，實現對某一個物種重復組和基因組的整體分析。其具有檢測速度快、準確率高、成本低、覆蓋面廣、擴展性強等特點，特別適合于兒童智力障礙或發育遲緩等遺傳性病因不明疾病相關影響因子的篩查。

綜上所述，本研究采用SNP微陣列和基因捕獲測序技術聯合對智力障礙或發育遲緩兒童進行診斷，進而篩查出染色體異常、CNV和個體遺傳突變誘發病變后果。研究從3人CNV分析中發現有1人在染色體11號的末端q24.1q25區帶存在13.16 Mb缺失，被證實會引起發育遲緩、雙眼裂小、貫通手癥狀；另1人為染色體21號的末端q22.2q22.3區帶存在6.1 Mb缺失，被證實會引起發育遲緩、癲癇、臍疝等不良癥狀；最后1人為染色體12號的末端存在q22.1q23區帶10.4 Mb缺失，被證實會引起發育遲緩、頭圍異樣、眼球震顫、特殊面容、肌張力高、屈曲趾、拇指內收、寬乳距、肘膝屈曲、不追光等癥狀。通過PCR定量檢查發現上述3名患兒所攜帶的CNVs都是新生變異，病原體是明確的，臨床和報告的隱性模型是一致的。

鑒于當下國內外基于診斷智力缺陷或單一基因發育遲緩的第二代序列主要包括外部質子組的序列和靶基因捕獲序列，其存在著檢測成本高、數據分析復雜、難以在臨床上廣泛應用的缺點；本研究的創新點在于設計了1016個基因探針，這些探針目前已被識別或可能與智力缺陷或生長遲緩有關，通過在微陣列芯片測試并針對陰性結果對基因進行排序，篩選出了6個單純基因疾病病例、3個病例存在可疑的情況；其中患兒例7屬陰性及有先天性心臟病和癲癇存在，檢測結果表明在多個前期異常——肌肉衰竭——癲癇中進行的研究提示，在患有I型癲癇痛綜合征的患兒中發現了該突變，其臨床和遺傳分析的結果與過住文獻所述的一種癲癇綜合征（OMIM:614080）相符[17]。

除了上述6個經證實的病例外，本研究還在1個病例中發現了CDH15，一種智力遲緩基因Ⅲ型，出現移碼突變，正常情況下其父本也應存在c.2310delG移碼突變，其突變蛋白預測應為病原體，但有關參考文獻顯示該基因為外顯不全可能，因此該突變只能被懷疑為可能與疾病有關。但對該基因的相關研究太少，突變是病原體所致目前尚未得到充分的研究證實。另外研究還發現，有1例患兒攜帶SEMA6D基因，被檢測出為c.1900_1903delAAGA的新生雜合突變，Ercan-Sencicek等[18]研究表明該基因可能與語言發育障礙有關，也不排除與兒童臨床表型關聯。

另外，類似的神經系統類不明原因智力低下病癥可能由CNV或簡單的基因突變引起，而不同的CNV突變可能根據所涉及的基因差異而具有不同的臨床表現。本研究的技術革新體現在SNP微陣列和新一代測序技術聯合可以有效地彌補傳統單一技術層面測序技術的不足，其可準確診斷單個基因對智力低下或發育遲緩的影響，該技術創新能很好地提供病因學診斷及遺傳機制研究，為遺傳咨詢、產前診斷、新生兒疾病發作風險評估提供科學的理論依據，具有重要的臨床意義。

由于智力障礙或發育遲緩的患兒存在著臨床診斷多樣性和復雜性等難題，即使在發達國家，也只有約50%的患者有中、重度病理診斷。隨著圍生期檢測技術的發展和孕、產婦生活質量的提高，不良環境因素影響的比例相對大幅下降，而遺傳因素的影響卻表現得越來越突出，25%～50%的智力缺陷是遺傳基因所致，其存在較大的隱蔽性。如何深入繪制患兒完整的基因突變圖譜、踐行基因干預醫治是永恒的課題。如何破譯更多致病基因是下一步的探究方向，尤其是不明遺傳因素性疾病，包括染色體異常、CNV和個體遺傳突變等，尚需深入研究。

4 結語

智力障礙或發育遲緩患兒的致病原因往往較復雜，遺傳性、不規則性較大。目前該病癥超過一半的臨床人群不能被診斷出明確的病因。而采用SNP微陣列和新一代基因捕獲測序技術對不明原因導致的智力障礙或發育遲緩患兒的研究，可為病因學診斷及遺傳機制研究提供良好的基礎信息，并為遺傳咨詢、產前診斷、新生兒疾病發作風險評估提供科學的理論依據。