以羧基化石墨烯量子點為載體的熒光-磁共振雙模態分子探針的制備及體外研究

李忠濤，陳頌，郝利國，郭靖，谷弘謙，劉強，王麗，王雷，李國華

1.齊齊哈爾醫學院附屬第一醫院 影像科，黑龍江 齊齊哈爾 161041；2.齊齊哈爾醫學院 a.藥學院藥物化學研究室；b.醫學技術學院分子影像研究室，黑龍江 齊齊哈爾 161000；3.齊齊哈爾醫學院附屬第三醫院 放射影像中心，黑龍江 齊齊哈爾 161000

引言

磁共振成像（Magnetic Resonance Imaging，MRI）具有多方向性和多參數的成像特征，可以顯示解剖結構的細節并提供其他信息，但細胞、分子水平成像靈敏度較低。熒光成像技術依靠外界能量激發熒光物質，引起電子的躍遷并在返回基態的過程中產生可被檢測的熒光信號，熒光探針具有靈敏度高、非侵入性、實時成像等優點，微量的熒光物質即可在細胞水平上觀察成像。因此，MRI熒光雙模態成像可以為疾病的診斷和治療提供更多有用的信息，逐漸成為研究熱點。近年來，已有多篇文章報道磁共振顯像劑結合熒光物質合成多功能探針的報告[1-3]。石墨烯量子點（Graphene Quantum Dots，GQDs）是石墨烯的衍生物，有著獨特的光學性質[4-5]。有研究表明，與其他石墨烯衍生物相比（如氧化石墨烯），GQDs有著較好的生物相容性、較低的生物毒性[6-7]。作為一種新型的熒光材料，GQDs具有抗光漂白能力、優良的光學性能[8]。因此，GQDs與其功能化材料已在生物成像、藥物輸送等領域被廣泛應用。Gd3+因其具有7個不成對的電子，可以降低組織內氫質子的弛豫時間，T1成像呈現高信號；與大分子螯合物結合后失去細胞毒性，被廣泛應用于臨床顯像如釓噴酸葡胺；新型Gd基造影劑的開發也在進行[9]。本研究將磁共振T1正向對比劑Gd3+負載于GQDs上，其中GQDs作為載體與熒光顯像劑，合成雙模態分子探針，討論制備探針的理化性質并探討其細胞成像與小動物成像潛能；本研究的主要目的是為GQDs載藥研究及靶向探針的制備奠定一定基礎。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

（1）試劑耗材。肝癌細胞HepG2、甲狀腺癌細胞FRO、肺癌細胞A549購自中國科學院上海細胞庫。GQDs購自先豐納米材料科技有限公司。N-羥基琥珀酰亞胺（N-hydroxysuccinimide，NHS）及 1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7,10-四乙酸（1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid，DOTA）購自艾覽化工科技有限公司。1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽（1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride，EDC）購自Adamas，聚乙二醇雙胺（H2NPEG-NH2，M.W2000）購自 Sigma，GdCl3·6H2O 購自上海阿拉丁試劑公司。

（2）儀器設備。熒光分光分度計（RF-5301PC，日本島津）；紫外分光光度計（UV-2550，日本島津）；傅立葉轉換顯微紅外光譜儀（Nicolet-IN10，美國賽默飛世爾）；透射電鏡（HT-7700，日本日立）；粒度分析儀（NICOMP-380ZLS，美國PSS）；3.0 T磁共振（Achieva，飛利浦）；多功能酶標儀（SAFIRE2，瑞士Tecan）；冷凍干燥儀（HXLG-12-50D，上海滬析）；NM120核磁共振造影劑弛豫率分析與成像系統（蘇州紐邁分析儀器股份有限公司）；電感耦合等離子體質譜-質譜儀（ICP-MS，Agilent 770s，美國）；美國光譜醫學即用型透析袋（截留分子量3500 Da），實驗所用溶液均用去離子水配置。

1.2 Gd@GQDs的制備

分別精確稱取H2N-PEG-NH2（M.W2000）和DOTA（摩爾比為4：1），放入含有EDC的溶液中，使用0.01 mol/L的鹽酸溶液將溶液pH調整到6，加入NHS，混勻后室溫攪拌12 h后，加入100 mL（0.1 mg/mL）羧基化GQDs溶液，再次室溫攪拌12 h后，以去離子水為透析液將未反應的EDC/NHS除去，得到產物H2N-PEG-DOTA-GQDs；將GdC13.6H2O加入GQDs-DOTA的醋酸鈉緩沖液（pH 5.5）中攪拌24 h，將Gd3+鰲合于DOTA中，多余的Gd3+以透析的方法除去。最后，將所得到的Gd@GQDs凍干待用。

1.3 Gd@GQDs的表征檢測

用透射型電子顯微鏡觀察形態、大小、分布等，用紫外-可見光分光光度計、熒光光譜儀檢測光學性質，用傅立葉變換紅外光譜檢測表面官能團，用粒度分析儀檢測水合粒徑及Zeta電位。

1.4 Gd3+濃度的測定

將釓元素溶液標準物質加入硝酸溶液中，配置成不同濃度的標準液。用ICP-MS測定所配置標準液，以濃度對信號強度作圖，得到標準曲線。將樣品混勻后，準確稱取5 mL樣品至50 mL消解容器中，加入1：1硝酸，放入石墨加熱板120～200 ℃消解20～60 min，至樣品消解完全，趕酸，冷卻后過濾，定容至10 mL量瓶中上儀器測試。結合標準曲線，即可得到Gd3+量。

1.5 弛豫性能檢測

使用飛利浦3.0 T磁共振掃描儀獲取Gd@GQDs（Gd3+濃度0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.6和0.8 mmol/L）的T1加權T2加權MR圖像。T1圖是使用反轉恢復序列獲得的，參數如下：TR/TI 2000/800 ms，TE 20 ms，矩陣 232×139，層厚4 mm，FOV 230 mm×198 mm。T2加權圖像參數如下：TE 108 ms，TR 4000 ms，矩陣256×256，切片厚度4 mm，FOV 230 mm×230 mm。使用NM120核磁共振造影劑弛豫率分析與成像系統，使用反轉恢復序列進行分析，具體參數如下 ：SW 100 kHz，TW 3000 ms，RFD 0.08 ms，NS 4，TE 1 ms，NTI 25。分別檢測其中4個樣品（Gd3+濃度為0.1、0.2、0.6和0.8 mmol/L）對應的縱向弛豫時間T1，橫坐標為Gd3+濃度，縱坐標為1/T1，將所得坐標點數據使用origin 8軟件進行擬合，所得擬合曲線的斜率即為Gd@GQDs的弛豫率r1。

1.6 細胞培養

復蘇HepG2、FRO、A549細胞，分別接種于含青霉素/鏈霉素與10%胎牛血清的RPMI 1640培養基中，在37 ℃、5% CO2培養箱中培養，取對數生長期細胞進行相關實驗。

1.7 細胞毒性實驗

為評價制備探針的體外細胞毒性，使用CCK-8法檢測細胞毒性。將HepG2、FRO、A549細胞分別置于不同的96孔板中，每孔加入細胞懸液100 μL，37℃預孵育96孔板。貼壁過夜后，棄舊培養基，加入新培養基，分別在每孔中加入不同濃度（0、25、50、75、100、150和200 μg/mL）Gd@GQDs溶液，每組設置6個復孔，孵育24 h，然后在各孔加入10 μL的CCK-8溶液，孵育3 h。只存在培養基與CCK-8溶液的為空白組。使用多功能酶標儀測量在490 nm波長的吸光度。細胞毒性測定方法為將細胞存活率與對照組比較。計算公式為：細胞活力（%）=[A(加藥)-A（空白）]/[A（不加藥）-A（空白）]×100%。

1.8 統計學分析

納米粒徑使用Nano Measure 1.2軟件分析，所得數據使用SPSS 13.0軟件分析，計量資料用±s表示，組間比較使用單因素方差分析，P＜0.05為差異具有顯著性。

2 結果

2.1 Gd@GQDs的表征

Gd@GQDs凍干后呈白色粉末狀；在制備過程中，液體均為無色透明狀態，未見絮狀物沉積，水溶性好。TEM圖如圖1a所示，平均粒徑約為（31.58±11.82）nm，呈圓形，大小較為一致，分散性良好；水合粒徑如圖2所示，平均粒徑為（39.7±21.5）nm，呈正態分布；Zeta電位測試結果如圖3所示，Gd@GQDs電位為-17.95 mV。

圖1 Gd@GQDs的表征

圖2 水合粒徑

圖3 ZETA電位

考察Gd@GQDs在PBS、DMSO和1640溶液中的穩定性。圖4a顯示，Gd@GQDs可以均一地分散在不同的溶液中；圖4b為靜置7 d后，各個溶液狀態未出現明顯改變。

圖4 Gd@GQDs的穩定性

Gd@GQDs在不同激發波長下的熒光光譜圖如圖5所示，最適激發波長為350 nm左右，在手持紫外燈照射下呈藍色，隨著激發波長的增加，出現發射波長隨之增加的量子點典型特征；紫外吸收光譜如圖6所示，Gd@GQDs的紫外吸收曲線在240 nm出現明顯的特征吸收。

圖5 Gd@GQDs在不同波長下的熒光光譜

圖6 紫外吸收光譜

Gd@GQDs的紅外光譜圖如圖7所示，Gd@GQDs在3404 cm-1出現了OH的伸縮振動峰，2886 cm-1飽和C-H的伸縮振動峰，1620 cm-1C=O雙鍵的伸縮振動峰，1111 cm-1聚乙二醇中醚的伸縮振動峰。

圖7 Gd@GQDs的紅外光譜

2.2 弛豫性能檢測

ICP-MS結果顯示Gd3+摻雜質量分數為2.46%。如圖8所示，隨著Gd3+濃度的增高，T1加權MR圖像亮度隨之增加，呈明顯陽性信號，圖中純水為低信號；T2加權圖像顯示水為高信號。且隨著Gd3+濃度的增高，T2加權MR圖像亮度隨之降低。表1為NM120核磁共振造影劑弛豫率分析與成像系統測量Gd@GQDs縱向弛豫時間的結果。圖9為線性擬合后所得直線方程，結果顯示Gd@GQDs的弛豫率為r1=9.05 mM-1S-1，大于臨床所用釓噴酸葡胺弛豫率，相關性為R2=0.998，呈現正相關。

表1 不同Gd3+濃度下的T1弛豫時間

圖8 加權成像圖

圖9 T1弛豫時間線性擬合

2.3 細胞毒性實驗

使用CCK-8法評估Gd@GQDs的細胞毒性，WST-8在電子載體的作用下被細胞線粒體中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲臜產物，生成的甲臜物的數量與活細胞的數量成正比。用多功能酶標儀在490 nm波長處測定其光吸收值，可以反映活細胞數量。HepG2、FRO、A549細胞在不同濃度的（25、50、75、100、150、200 μg/mL）Gd@GQDs 中培養 24 h 的細胞存活率結果如表 2 所示，結果顯示，不同濃度的Gd@GQDs 作用于上述細胞24 h后，均顯示出較高水平細胞存活率（＞70%）。

表2 細胞存活率（%）

3 討論

納米材料與納米醫學的發展，為生物標記提供了新的思路[10]。GQDs作為石墨烯家族的新成員，通常由較小的石墨烯碎片組成，不僅具有石墨烯的特性，還具有量子點的量子限域效應、量子隧道效應以及邊緣效應[11-12]。GQDs在生物醫藥中進行了廣泛的應用，如標記神經干細胞[13]、Hela細胞[14]等，負載治療藥物如阿霉素、MTX[15-16]。李大鵬等[17]還研究了GQDs對膀胱癌T24細胞的作用，發現經激光照射后GQDs對細胞有明確的殺傷作用。目前已有GQDs結合磁共振材料合成雙模態分子探針的研究報告[1-3]。但既往研究尚缺乏新型材料羧基化GQDs結合磁共振T1陽性對比劑Gd3+的研究數據。

本實驗將Gd3+通過大分子螯合物修飾，與雙氨基聚乙二醇一同連接到載體羧基化GQDs上，制備了熒光-磁共振雙模態探針，證實了探針制備的路線及應用于體內外標記領域的可行性。本次實驗制備的Gd@GQDs由TEM圖可見，粒徑約為（31.58±11.82）nm；水合粒徑為（39.7±21.5）nm，呈正態分布；本次實驗結果顯示水合粒徑較TEM結果較大可能是探針表面存在羧基等官能團及PEG修飾后表面形成水化膜所致；Gd@GQDs電位為-17.95 mV。粒徑的大小、電性、親疏水性會影響探針在體內的循環時間，粒徑過大（＞500 nm）或過小（＜10 nm）會被網狀內皮細胞截留或腎臟代謝，而腎臟毛細血管壁因帶負電，傾向于清除帶正電的顆粒，疏水性大的顆粒易被血液中蛋白清除[18-19]。本實驗合成的探針粒徑為10～100 nm，經PEG修飾后親水性良好，帶負電，在體內可擁有更長的體內循環時間，可保證探針在病變部位富集，圖4a的結果也證明合成的Gd@GQDs在不同的溶液中具有良好的分散性與穩定性，為其作為理想的載藥探針提供了保證。制備的探針具有較低的細胞毒性，CCK-8法檢測細胞毒性的結果顯示，當Gd@GQDs濃度為100 μg/mL時，HepG2、FRO、A549，3種細胞活度仍在90%左右，濃度為200 μg/mL時3種癌細胞的存活率都在70%以上，表明該探針細胞毒性較低，其原因可能有以下三點：① Gd3+螯合在大分子DOTA中，而非以游離態形式存在[20-21]；② GQDs具有較低的生物毒性；③ Gd@GQDs納米探針外圍修飾有聚乙二醇與大量的親水官能團以保證探針的親水性。圖6紫外吸收與圖7紅外光譜圖中特征吸收峰可證明探針制備成功[21-25]；MR圖像結果顯示Gd@GQDs作為T1陽性對比劑的潛力，使用紐邁磁共振檢測得到Gd@GQDs的r值為9.05 mM-1S-1，遠大于臨床用釓噴酸葡胺的弛豫率（約為2倍），這意味著較釓噴酸葡胺，可以使用更少的Gd@GQDs來達到同樣的成像效果，具備應用于小動物體內MRI的應用前景，Gd@GQDs具有很高弛豫率的原因是：相較于小分子造影劑，大分子造影劑因其尺寸較大，可以改善整個分子的磁學性質，減緩分子的旋轉運動，提高弛豫率。

綜上所述，本次實驗證明了新型材料羧基化GQDs與Gd3+合成雙模態探針的可行性，其穩定性好、細胞毒性低，具備體外熒光成像及MRI的應用前景；為進一步實驗奠定了一定基礎，如石墨烯通過π-π共軛載藥研究；或進一步對MRI進行研究，如研究探針體內清除速率等；或利用GQDs較大的比表面積連接單抗或小分子抑制劑等靶向基團，從而實現靶向探針或者診療一體化探針的制備。