益生菌干預治療狼瘡腎炎Ⅳ～Ⅴ型患者的效果研究

黃朦，黃存軍，歐秋娟，戴洪波，何階德，梁航，陳喆，徐秋筆

狼瘡腎炎（LN）是系統性紅斑狼瘡（SLE）嚴重的并發癥之一，臨床可出現單純性蛋白尿、血尿、氮質血癥、高血壓和水腫等，常表現為慢性腎小球腎炎和腎病綜合征，LN患者隨著病程延長易發生終末期腎臟病，嚴重威脅患者生命健康[1-2]。有研究發現腸道菌群紊亂與LN進程關系密切，LN患者腸道菌群具有明顯促炎作用，易導致自身免疫功能障礙的特征性改變[3]。有研究顯示，在LN經典模型MRL/lpr小鼠中，口服乳桿菌可明顯改善雌鼠和閹割雄鼠的腎功能及其存活率[4]。因此，本研究旨在探討益生菌干預治療LN的臨床療效，并觀察其對腎功能改善、腸道菌群變化以及短鏈脂肪酸的影響。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2019—2020年于湘南學院附屬醫院收治的Ⅳ型和Ⅴ型LN患者。納入標準：（1）符合2019年美國風濕病協會制定的SLE分類診斷標準[5]；（2）年齡18～65歲；（3）經腎活檢確診，參照SLE腎臟疾病活動指數（R-SLEDAI）評分[6]評估為靜止組的患者。排除標準：（1）合并其他自身免疫系統疾病；（2）合并腫瘤性疾病；（3）合并急慢性感染、重大創傷、手術等；（4）合并其他系統引起的腎臟病變，如高血壓、糖尿病等引起的腎臟病變；（5）合并其他臟器嚴重疾病，如心臟、肺、肝臟、消化系統、神經系統等嚴重疾病。

本研究共納入98例LN患者，納入患者均知情同意。本研究經過湘南學院附屬醫院倫理委員會審批通過（倫理批號：XNXY-2019-0105）。

1.2 研究設計 采用隱匿數字隨機法將LN患者分為常規治療組和干預治療組，每組各49例。常規治療組使用激素、羥氯喹和血管緊張素轉換酶抑制劑（ACEI）治療（常規治療）；干預治療組在常規治療組治療基礎上，給予雙歧桿菌四聯活菌片1.5 g口服，3次/d。隨訪24周。

1.3 觀察指標

1.3.1 治療前一般資料與臨床指標 患者接受治療前1 d，記錄患者一般資料，包括性別、年齡、體質指數（BMI）、收縮壓和舒張壓；檢測血紅蛋白、血清白蛋白、血肌酐（Scr）、補體C3和補體C4。

1.3.2 臨床療效評價 患者治療前和治療24周后，采用R-SLEDAI評分評估疾病的活動性,評分越高代表病情越嚴重。

1.3.3 實驗室檢查指標 患者接受治療前和治療4、12、24 周后檢測24 h尿蛋白定量、尿素氮（BUN）、Scr、免疫球蛋白（Ig）E和IgG水平。患者接受治療前和治療24 周后采用酶聯免疫吸附法檢測血清C反應蛋白（CRP）、白介素（IL） -6、腫瘤壞死因子（TNF）-α水平。

1.3.4 腸道菌群檢測 選取同期本院體檢中心體檢健康者16例作為健康志愿者。收集健康志愿者、LN患者（患者治療前）、常規治療組治療24周后、干預治療組治療24周后的糞便。（1）取糞便約2 g，裝入2 ml無菌凍存管中，置于液氮中速凍，然后轉移到-80 ℃超低溫冰箱中保存。（2）使用DNA提取試劑盒提取DNA后，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取質量，同時采用紫外分光光度計對DNA進行定量。（3）對細菌16S rDNA基因V3～V4區域進行PCR擴增。16S rDNA基因V3～V4區引物序列正向引物：5'-CCTACGGGNGGCWGCAG-3'，反向引物 5'-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3'。PCR反應程序為：首先在98 ℃條件下預變性30 s；然后進行35個循環，包括：98 ℃變性10 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s；最后在72 ℃條件下延伸10 min。PCR產物經2%瓊脂糖凝膠電泳進行證實。在整個DNA提取過程中，使用超純水排除假陽性PCR結果作為陰性對照的可能性，PCR產物由AMPure XT beads（Beckman Coulter Genomics，Danvers，MA，美國）純化，Qubit（Invitrogen，美國）定量。擴增子池用于測序，擴增子文庫的大小和數量分別在Agilent 2100生物分析儀（ Agilent， 美國）和 Illumina （Kapa Biosciences，Woburn，MA，美國）的文庫定量試劑盒上進行評估。在NovaSeq PE250平臺上對庫進行排序。（4）樣品按照制造商的建議進行測序，由LC-Bio提供。根據樣品獨特的條形碼，將配對端序列分配給樣品，并將建庫引入的barcode和引物序列去除。使用FLASH合并匹配端讀取。根據fqtrim（v0.94），在特定的過濾條件下對原始數據進行質量過濾，以獲得高質量的clean標簽。使用Vsearch軟件對嵌合序列進行過濾。利用DADA2（Divisive Amplicon Denoising Algorithm）進行解調，使用ASVs（Amplicon Sequence Variants）的概念構建類操作分類單位（Operational Taxonomic Units，OTU）表，獲得最終的feature特征表以及特征序列。多樣性通過歸一化到相同的隨機序列來計算。然后根據SILVA（release 132）分類器，利用每個樣本的相對豐度對特征豐度進行歸一化。采用Blast進行序列比對，每個代表性序列用SILVA數據庫對特征序列進行注釋。采用LEfSe 分析腸道菌群豐度。

1.3.5 短鏈脂肪酸檢測 采用氣相質譜分析法測定健康志愿者、LN患者、常規治療組治療24周后和干預治療組治療24周后糞便中短鏈脂肪酸（甲酸、乙酸、丙酸、丁酸）含量。（1）將新鮮糞便使用蒸餾水以1∶9進行均值稀釋，混勻，于-80 ℃保存備用。（2）使用固相動態微萃取技術將混合物分離，將所得上清液使用氣相質譜分析，條件為：色譜柱VF-WAXms，0.25 mm×30.00 m，0.25 μm，初始 溫度 70 ℃，保持1 min，按10 ℃/min升溫速率升溫至200 ℃，保持2 min，30 ℃/min升溫速率升溫至240 ℃，保持2 min，進樣口溫度為250 ℃。（3）將所得產物進行質譜分析，測量樣本中甲酸、乙酸、丙酸、丁酸含量。

1.4 統計學方法 應用SPSS 17.0和GraphPad 8統計軟件對數據進行統計分析，符合正態分布的計量資料以（±s）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，組內比較采用配對t檢驗；多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。分類資料的組間比較采用χ2檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 患者治療前一般資料及臨床指標比較 本研究最終共93例患者完成試驗，其中常規治療組46例，干預治療組47例。兩組患者性別、年齡、BMI及治療前收縮壓、舒張壓、血紅蛋白、血清白蛋白、Scr、補體C3和補體C4比較，差異均無統計學意義（P>0.05），見表1、2。

表1 兩組患者治療前一般資料比較Table 1 Comparison of general between lupus nephritis patients treated with routine treatment，and routine treatment plus probiotics at baseline

表2 兩組患者治療前臨床指標比較（±s）Table 2 Comparison of clinica indices between lupus nephritis patients treated with routine treatment，and routine treatment plus probiotics at baseline

表2 兩組患者治療前臨床指標比較（±s）Table 2 Comparison of clinica indices between lupus nephritis patients treated with routine treatment，and routine treatment plus probiotics at baseline

注：Scr=血肌酐

補體C4（g/L）常規治療組 46 76.0±13.3 26.68±6.38 61.99±12.07 0.55±0.20 0.11±0.03干預治療組 47 75.6±12.6 25.96±6.05 62.03±12.96 0.56±0.15 0.12±0.02 t值 0.049 0.559 0.015 0.273 1.895 P值 0.961 0.578 0.988 0.785 0.061組別 例數 血紅蛋白（mmol/L）血清白蛋白（g/L）Scr（μmol/L）補體C3（g/L）

2.2 臨床療效評價 治療前，兩組患者R-SLEDAI評分比較，差異無統計學意義（P>0.05）。治療24周后，干預治療組SLEDAI評分低于常規治療組，差異有統計學意義（P<0.05），見表3。

表3 兩組患者治療前后SLEDAI評分比較（±s，分）Table 3 Comparison of SLEDAI scores between lupus nephritis patients treated with routine treatment，and routine treatment plus probiotics before and after treatment

表3 兩組患者治療前后SLEDAI評分比較（±s，分）Table 3 Comparison of SLEDAI scores between lupus nephritis patients treated with routine treatment，and routine treatment plus probiotics before and after treatment

組別 例數 治療前 治療24周后常規治療組 46 16.8±4.9 8.7±3.6干預治療組 47 17.3±5.1 6.3±2.1 t值 0.520 4.090 P值 0.604 <0.001

2.3 患者治療前后腎功能變化情況 治療前兩組患者24 h 尿蛋白定量、BUN、Scr比較，差異無統計學意義（P>0.05）；治療4、12、24 周后，兩組患者24 h尿蛋白定量、BUN、Scr較治療前降低，差異有統計學意義（P<0.05）；治療4、12、24周后，干預治療組患者24 h尿蛋白定量和BUN均低于常規治療組，治療24周后Scr低于常規治療組，差異有統計學意義（P<0.05），見表4～6。

表4 兩組患者治療前后24 h尿蛋白定量比較（±s，g）Table 4 Comparison of 24-hour urinary protein between lupus nephritis patients treated with routine treatment，and routine treatment plus probiotics before and after treatment

表4 兩組患者治療前后24 h尿蛋白定量比較（±s，g）Table 4 Comparison of 24-hour urinary protein between lupus nephritis patients treated with routine treatment，and routine treatment plus probiotics before and after treatment

注：a表示與治療前相比P<0.05

組別 例數 治療前 治療4周后 治療12周后 治療24周后常規治療組 46 4.79±1.52 3.82±1.19a 2.65±0.69a 1.48±0.11a干預治療組 47 4.82±1.69 3.27±1.32a 1.94±0.79a 1.03±0.18a t值 0.090 2.109 4.612 14.510 P值 0.929 0.038 <0.001 <0.001

表5 兩組患者治療前后BUN比較（±s，mmol/L）Table 5 Comparison of BUN between lupus nephritis patients treated with routine treatment，and routine treatment plus probiotics before and after treatment

表5 兩組患者治療前后BUN比較（±s，mmol/L）Table 5 Comparison of BUN between lupus nephritis patients treated with routine treatment，and routine treatment plus probiotics before and after treatment

注：a表示與治療前相比P<0.05

組別 例數 治療前 治療4周后 治療12周后 治療24周后常規治療組 46 15.87±1.62 13.13±1.51a 10.25±1.59a 8.64±1.08a干預治療組 47 15.92±1.87 12.49±1.49a 9.59±1.02a 7.08±1.39a t值 0.138 2.057 2.388 6.035 P值 0.891 0.043 0.019 <0.001

表6 兩組患者治療前后Scr比較（±s，μmol/L）Table 6 Comparison of Scr between lupus nephritis patients treated with routine treatment，and routine treatment plus probiotics before and after treatment

表6 兩組患者治療前后Scr比較（±s，μmol/L）Table 6 Comparison of Scr between lupus nephritis patients treated with routine treatment，and routine treatment plus probiotics before and after treatment

注：a表示與治療前相比P<0.05

組別 例數 治療前 治療4周后 治療12周后 治療24周后常規治療組 46 132.81±9.33 118.95±8.77a 97.35±7.13a 82.42±5.92a干預治療組 47 133.61±8.76 117.11±8.42a 98.29±6.24a 75.18±5.84a t值 0.426 1.032 0.677 5.937 P值 0.671 0.305 0.500 <0.001

2.4 患者治療前后血清IgE、IgG水平變化 兩組患者治療前血清IgE、IgG水平比較，差異無統計學意義（P>0.05）；治療24周后，兩組患者血清IgE、IgG水平均較治療前下降，且干預治療組患者血清IgE、IgG水平低于常規治療組，差異有統計學意義（P<0.05），見表7。

表7 兩組患者治療前后血清IgE、IgG水平比較（±s，g/L）Table 7 Comparison of serum IgE and IgG between lupus nephritis patients treated with routine treatment，and routine treatment plus probiotics before and after treatment

表7 兩組患者治療前后血清IgE、IgG水平比較（±s，g/L）Table 7 Comparison of serum IgE and IgG between lupus nephritis patients treated with routine treatment，and routine treatment plus probiotics before and after treatment

注：Ig=免疫球蛋白；a表示與治療前相比P<0.05

組別 例數 IgE IgG治療前 治療24周后 治療前 治療24周后常規治療組 46 26.32±3.42 21.89±2.87a 15.92±3.22 12.93±2.47a干預治療組 47 26.51±3.15 18.60±1.53a 16.03±3.24 10.28±2.65a t值 0.278 6.919 0.164 4.986 P值 0.781 <0.001 0.870 <0.001

2.5 患者治療前后血清炎性因子水平變化 兩組患者治療前CRP、IL-6、TNF-α水平比較，差異無統計學意義（P>0.05）。治療24周后，兩組患者CRP、IL-6、TNF-α水平均較治療前下降，且干預治療組患者CRP、IL-6、TNF-α水平低于常規治療組，差異有統計學意義（P<0.05），見表8。

表8 兩組患者治療前后血清CRP、IL-6、TNF-α水平比較（±s）Table 8 Comparison of serum CRP，IL-6 and TNF-α between lupus nephritis patients treated with routine treatment，and routine treatment plus probiotics before and after treatment

表8 兩組患者治療前后血清CRP、IL-6、TNF-α水平比較（±s）Table 8 Comparison of serum CRP，IL-6 and TNF-α between lupus nephritis patients treated with routine treatment，and routine treatment plus probiotics before and after treatment

注：CRP=C反應蛋白，IL=白介素，TNF-α=腫瘤壞死因子α；a表示與治療前相比P<0.05

組別 例數 CRP（mg/L） IL-6（μg/L） TNF-α（μg/L）治療前 治療24周后 治療前 治療24周后 治療前 治療24周后常規治療組 46 2.68±0.96 1.43±0.75a 21.96±2.21 8.05±2.32a 4.65±0.67 1.78±0.68a干預治療組 47 2.69±1.05 1.09±0.69a 22.08±2.21 6.67±2.48a 4.73±0.69 1.16±0.73a t值 0.048 2.276 0.262 2.770 0.567 4.236 P值 0.962 0.025 0.794 0.007 0.572 <0.001

2.6 腸道菌群變化 LEfSe分析顯示，健康志愿者糞便中疣微菌門（Verrucomicrobia）、韋榮球菌科（Erysipelotrichaceae）、 阿 克 曼 菌 屬（Akkermansia）等菌群含量較高，LN患者治療前糞便中幽門螺桿菌屬（Helicobacter pylori）、梭狀芽孢桿菌（Clostridium）、腸球菌門（Enterococcus）等有害菌群含量增加；常規治療組和干預治療組治療后糞便中有害菌群含量降低，同時厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、嗜膽菌屬（Bilophila）等有益菌群含量增加。藥物治療后，糞便中阿克曼菌含量增加，見圖1。

圖1 健康志愿者、LN患者治療前及常規治療組、干預治療組治療24周后糞便腸道菌群LEfSe差異分析Figure 1 Taxonomic cladogram of LEfSe analysis of fecal flora between healthy controls，lupus nephritis patients before treatment，lupus nephritis patients treated with routine treatment，and routine treatment plus probiotics

2.7 糞便短鏈脂肪酸含量變化 與健康志愿者比較，LN患者治療前糞便中甲酸、乙酸、丙酸、丁酸含量降低，差異有統計學意義（P<0.05），見表9。健康志愿者及常規治療組、干預治療組治療24周后糞便中甲酸含量比較，差異無統計學意義（P>0.05）。健康志愿者及常規治療組、干預治療組治療24周后糞便中乙酸、丙酸、丁酸含量比較，差異有統計學意義（P<0.05），其中常規治療組治療24周后和干預治療組治療24周后糞便中乙酸、丙酸、丁酸含量均較健康志愿者增加，且干預治療組治療24周后糞便中乙酸、丙酸、丁酸含量較常規治療組治療后增加，差異有統計學意義（P<0.05），見表10。

表9 健康志愿者和LN患者治療前糞便中短鏈脂肪酸含量比較（±s，μg/g）Table 9 Changes of short-chain fatty acid concentrations in feces between healthy controls and lupus nephritis patients before treatment

表9 健康志愿者和LN患者治療前糞便中短鏈脂肪酸含量比較（±s，μg/g）Table 9 Changes of short-chain fatty acid concentrations in feces between healthy controls and lupus nephritis patients before treatment

樣本 例數 甲酸 乙酸 丙酸 丁酸健康志愿者 12 254.03±26.27 259.68±27.38 246.61±26.01 249.23±26.28 LN 患者 93 232.12±21.50 153.99±13.21 146.21±12.51 147.76±12.65 t值 3.726 12.01 26.14 25.57 P值 <0.01 <0.01 <0.01 <0.0001

表10 健康志愿者及常規治療組、干預治療組治療24周后糞便中短鏈脂肪酸含量比較（±s，μg/g）Table 10 Changes of short-chain fatty acid concentrations in feces between healthy controls and lupus nephritis patients with routine treatment，and routine treatment plus probiotics

表10 健康志愿者及常規治療組、干預治療組治療24周后糞便中短鏈脂肪酸含量比較（±s，μg/g）Table 10 Changes of short-chain fatty acid concentrations in feces between healthy controls and lupus nephritis patients with routine treatment，and routine treatment plus probiotics

注：a表示與健康志愿者相比P<0.05，b表示與常規治療組治療24周后相比P<0.05

樣本 例數 甲酸 乙酸 丙酸 丁酸健康志愿者 12 254.03±26.27 259.68±27.38 246.61±26.01 249.23±26.28常規治療組治療24周后 46 235.33±24.06 188.86±22.70a179.33±21.59a181.24±21.81a干預治療組治療24周后 47 246.48±34.28 216.31±23.42ab205.41±22.23ab207.59±22.47ab F值 2.736 46.788 46.783 46.785 P值 0.067 <0.01 <0.01 <0.010

2.8 安全性評價 治療24周后，兩組患者出現的肝功能異常、感染（上呼吸道、肺部、尿路）、腹瀉、心動過速以及其他藥物不良反應發生率比較，差異均無統計學意義（P>0.05），見表11。

表11 兩組患者治療后藥物不良反應情況比較〔n（%）〕Table 11 Comparison of adverse drug reactions after treatment between lupus nephritis patients treated with routine treatment，and routine treatment plus probiotics

3 討論

有研究發現，人體腸道菌群有助于維持機體糖脂代謝和免疫功能[7]。腸道菌群相關研究證實，在SLE、類風濕關節炎、多發性硬化癥、LN等自身免疫性疾病發病過程中均出現了腸道菌群紊亂的現象[8]。相關動物實驗發現，狼瘡小鼠腸道菌群中乳酸桿菌數量明顯減少，口服乳酸桿菌可以通過調節免疫反應改善小鼠腎功能并延長小鼠生存時間[9]，推測其可能與腸道菌群調節免疫應答、炎性反應、氧化應激、代謝等有關[10]。因此，本研究擬探討LN患者腸道菌群改變特征以及益生菌對患者腸道菌群、腎臟功能的影響。

本研究在常規治療的基礎上，給予LN患者益生菌輔助治療，結果顯示，相較于常規的羥氯喹加ACEI治療，添加益生菌的干預治療方式提高了LN患者的臨床有效率，常見實驗室檢查指標（24 h尿蛋白定量、BUN、Scr等）得到明顯改善，提示兩種治療方式均可以改善患者腎功能，防止腎病發展。經進一步檢測發現，患者血清IgE、IgG以及炎性因子水平治療后明顯降低，提示兩種治療方式均可以緩解患者血清中異常指標，并且益生菌干預治療組患者指標變化更明顯，益生菌干預治療可以起到更好的抗炎作用[11]。

LEfSe分析結果顯示，健康志愿者腸道菌群中疣微菌門、韋榮球菌科、阿克曼菌屬比例較高，LN患者糞便中幽門螺桿菌屬、梭狀芽孢桿菌、腸球菌門等有害菌群比例增加，治療后，LN患者糞便中有害菌群含量降低，同時厚壁菌門、擬桿菌門、嗜膽菌屬等有益菌群比例增加。SU等[12]研究發現，擬桿菌門和阿克曼菌可以增加腸黏膜屏障相關黏蛋白2（Muc-2）表達。本研究中，常規治療和干預治療均可以增加擬桿菌門豐度，藥物治療可以通過改善腸黏膜屏障和降低細胞旁通透性，減少細菌脂多糖入血，降低炎性反應，保護腎臟。此外，本研究中，常規治療和干預治療均可以增加厚壁菌門豐度，且藥物治療后，糞便中乙酸、丙酸、丁酸含量增加，提示藥物治療可以通過提高短鏈脂肪酸含量，提高腸上皮細胞能量代謝，改善LN病情，這與MEIJERS等[13]研究結果一致。2019年AZZOUZ等[3]檢測了61例SLE患者糞便腸道菌群和自身抗體水平，發現SLE患者微生物組物種豐富度多樣性降低，毛螺菌科瘤胃球菌（Ruminococcusgnavus，RG）含量明顯增加，并且發現血清中抗RG抗體與R-SLEDAI評分相關，與補體C3和補體C4呈負相關，提示RG菌群豐度與狼瘡疾病的活動性相關。然而在本研究中，并未發現患者治療前后RG菌群豐度的改變，推測疾病活動期患者和非疾病活動期患者的腸道菌群可能存在差異。

綜上所述，LN患者存在腸道菌群紊亂，益生菌干預治療可以增加腸道中有益菌群含量，減少有害菌群含量，提高短鏈脂肪酸含量，降低血清Ig水平，改善患者腎功能，提高臨床治療效果。但本研究未對LN患者進行生存隨訪，后續需長期隨訪并收集患者康復信息，進一步闡明腸道菌群在LN患者治療中的作用，為益生菌的臨床治療推廣提供理論依據。

作者貢獻：黃朦、徐秋筆提出研究主題，負責研究思路的設計并對文章負責，進行研究實施、樣本檢測、資料收集整理、撰寫論文；戴洪波、何階德進行研究的質量控制及審校；黃朦、黃存軍、歐秋娟、戴洪波、何階德、梁航、陳喆、徐秋筆參與研究實施、試驗檢測評估、技術操作和資料收集。

本文無利益沖突。