鯉Pdcd6ip蛋白真核表達載體的構建及抗病毒功能研究

邵 玲 張明輝 彭軍輝

(上海市水產研究所, 上海市水產技術推廣站, 上海, 200433)

鯉春病毒血癥病毒 (Spring viraemia of carp virus,SVCV)可以引起多種鯉科魚類, 如鯉(Cyprinus carpioLinnaeus)、錦鯉 (Cyprinus carpio haematopterus)和草魚 (Ctenopharyngodon idellusCuvier et Valenciennes)等發生急性、暴發性出血癥—鯉春病毒血癥 (Spring viraemia of carp, SVC)[1,2]。SVC常在春季水溫較低時暴發, 死亡率可高達90%以上,被世界動物衛生組織列為必須申報的疫病, 也是《中華人民共和國進境動物一、二類傳染病、寄生蟲病名錄》中的一類魚類疫病, 該病嚴重影響了漁業生產并造成了重大的經濟損失, 對我國水產養殖業的可持續發展構成了巨大威脅[3]。因此加強SVCV抗病毒機制的研究, 尋求有效的預防和治療方法具有重要的理論和實踐意義。

SVCV隸屬于彈狀病毒科Sprivivirus病毒屬, 病毒基因組為不分節段的單股負鏈RNA, 共編碼5個主要結構蛋白, 分別為核蛋白 (N)、磷蛋白 (P)、基質蛋白 (M)、糖蛋白 (G)和RNA聚合酶 (L)。N、P和M蛋白作為SVCV的主要結構蛋白, 在病毒的轉錄、復制及裝配中發揮了重要作用[1,2]。前期, 我們對SVCV感染的鯉魚上皮瘤細胞EPC (Epithelioma papulosum cyprinid)進行了蛋白質組學研究,結果發現, 相較于未感染細胞, 感染細胞中程序性細胞死亡6互作蛋白Pdcd6ip (Programmed cell death 6-interacting protein)的表達水平顯著上調。Pdcd6ip也稱為Alix或Aip1, 由pdcd6ip基因編碼。然而, 目前魚類中pdcd6ip基因的確定編碼序列及其在SVCV感染中的功能均還未知。哺乳動物中的研究表明,Pdcd6ip是內吞體分選轉運復合體Ⅲ (Endosomal sorting complexes required for transport Ⅲ, ESCRT-Ⅲ)的組成部分, 并在調控細胞程序性死亡中起到了重要作用[4]。Pdcd6ip可以結合ESCRT-Ⅲ中的CIN85、endophilins、CHMP4B和Tsg101等蛋白,還可以結合細胞凋亡相關蛋白ALG-2, 并參與ALG-2介導的細胞凋亡途徑[5,6]。Pdcd6ip在哺乳動物病毒復制循環中的作用已有初步研究, 結果顯示其在多種分子機制中發揮了不可或缺的橋梁作用。例如, Pdcd6ip可以結合病毒的晚期結構域, 如P(S/T)AP、YxxL和PPxY等, 進而參與有包膜病毒如人類免疫缺陷病毒 (HIV)和馬傳染性貧血病毒(EIAV)等的出芽及水泡性口炎病毒 (VSV)復制過程中核衣殼從內體到細胞質的轉運[7]。此外, HIV-1中的研究表明, 在病毒感染宿主細胞后, 子代病毒粒子需要在宿主Pdcd6ip的幫助下才能完成其出芽和釋放過程[8—10]。登革病毒 (DENV)中的研究表明, Pdcd6ip可以與其NS3蛋白發生相互作用, 在病毒感染晚期階段及病毒釋放過程中發揮了重要作用[11]。病毒成分在細胞內的轉運及完整病毒的出芽為病毒正常復制所必不可少, Pdcd6ip在調節病毒感染和復制中具有重要功能。因此, 其表達與否及表達水平的高低將影響病毒的感染和復制水平。然而, Pdcd6ip在不同病毒中所起的作用不同,例如, EIAV中的研究表明, Pdcd6ip的過表達抑制了其復制[12], 而HIV-1中的研究表明, Pdcd6ip的過表達促進了其復制[6]。目前, 魚類中Pdcd6ip的確定序列鮮有報道, 對魚類病毒如SVCV等增殖的影響也尚未揭示。

為了探討Pdcd6ip在SVCV感染中的功能, 本研究通過構建Pdcd6ip真核表達載體并轉染EPC細胞,檢測其過表達對病毒復制的影響。本研究將為SVCV抗病毒藥物的研發奠定科學基礎。

1 材料與方法

1.1 主要材料、試劑及實驗儀器

主要材料和試劑: 鯉上皮瘤細胞系EPC購于中國檢驗檢疫科學研究院, 用含10% FBS (胎牛血清)、1%雙抗 (100 μg/mL青霉素-鏈霉素)的M199培養基置于25℃恒溫培養。SVCV-265毒株由本實驗分離和保存[13], 采用50%組織培養感染劑量法(TCID50)和Reed-Müench法[14]進行病毒滴度的測定和計算。M199細胞培養基、0.25% Trypsin-EDTA、FBS和青霉素-鏈霉素溶液購自Gibco公司;甲基纖維素 (4000 cP)購自Sigma-Aldrich公司; 病毒RNA提取試劑盒購自Qiagen公司; cDNA合成試劑盒RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit購自Thermo公司; LATaq、DNA marker、T4 DNA連接酶、TB Green Premix ExTaqⅡ等均購自TaKaRa公司; pCI-neo載體購自Promega公司; 限制性內切酶購自NEB公司; 質粒提取試劑盒、凝膠回收試劑盒、ProBond Purification System蛋白純化試劑盒、轉染脂質體Lipofectamine 2000、Alexa flour 488標記的羊抗兔IgG均購自Invitrogen公司; 細胞增殖/毒性檢測試劑CCK-8購自Dojindo公司。

實驗儀器: 臺式冷凍離心機 (Eppendorf)、恒溫水浴鍋及恒溫搖床 (上海一恒)、-80℃立式超低溫冰箱 (Thermo)、核酸電泳儀、蛋白電泳儀及半干轉膜儀 (Bio-Rad)、凝膠成像儀(上海復日)、恒溫培養箱 (SANYO)、PCR儀及實時熒光定量熒光PCR儀 (Applied Biosystems)、化學發光儀 (Bio-Rad)、熒光倒置顯微鏡 (Olympus-IX73)、酶標儀(BioTek)。

1.2 鯉pdcd6ip基因cDNA的擴增

提取鯉組織總RNA, 并立即進行反轉錄獲得cDNA。根據NCBI中斑馬魚 (Danio rerio)pdcd6ip基因序列及鯉、鯽、黑頭軟口鰷 (Pimephales promelas)、金線鲃 (Sinocyclocheilus anshuiensisFang)等預測的pdcd6ip基因序列保守區設計引物pMD18-pdcd6ip-F和pMD18-pdcd6ip-R (表 1), PCR擴增鯉pdcd6ip基因cDNA, 將PCR產物純化回收后克隆至pMD18-T載體并進行序列測定。

表1 本研究所用引物Tab. 1 Primers used in this study

1.3 序列分析

用Bioedit 7.0、ContigExpress軟件進行序列拼接、多重比對和氨基酸同源性分析。利用MEGA 5.0軟件進行進化分析, 采用鄰接法 (Neighbor-joining, NJ)基于Pdcd6ip氨基酸序列構建系統進化樹。

1.4 Pdcd6ip蛋白真核表達載體的構建

根據pdcd6ip基因序列設計ORF區引物: pCI-pdcd6ip-F和pCI-pdcd6ip-R,以cDNA為模板進行PCR擴增。分別將回收的PCR片段和pCI-neo空載體在37℃用NheI和EcoR I雙酶切3h。將酶切片段和載體進行膠回收, 回收產物在T4連接酶的作用下進行連接反應, 16℃連接過夜。將連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞, 挑取單克隆并通過菌液PCR進行鑒定。陽性克隆進行擴大培養, 提取質粒并進行測序驗證, 將序列正確的重組質粒命名為pCI-pdcd6ip。

1.5 Pdcd6ip蛋白多克隆抗體的制備

設計正向引物pRSET-pdcd6ip-F和反向引物pRSET-pdcd6ip-R, 擴增pdcd6ip基因ORF區并將其插入pRSET-A載體中, 菌液PCR篩選陽性克隆, 并進行測序驗證。提取重組質粒pRSET-pdcd6ip轉化大腸桿菌感受態細胞BL21(DE3)pLysS。陽性克隆在37℃條件下, 加入1 mmol/L IPTG (異丙基-β-D-硫代半乳糖苷)進行蛋白誘導表達, 誘導后不同時間收取菌體, 破碎后進行SDS-PAGE電泳分析。表達蛋白進一步利用純化試劑盒進行純化, 純化后的蛋白免疫新西蘭白兔獲得特異性的抗血清, 抗血清進一步純化獲得特異性抗體, 抗體效價用ELISA方法進行測定。

1.6 細胞轉染

將EPC細胞接于24孔細胞培養板中, 第2天待形成單層細胞后進行轉染。以24孔板1孔為例: 將800 ng 質粒加入到50 μL Opti-MEM培養基中; 同時將2 μL脂質體Lipofectamine 2000加入到50 μL Opti-MEM中, 室溫靜置5min; 然后將兩者充分混勻, 室溫靜置20min; 用Opti-MEM輕輕洗細胞兩次, 將混合物加入對應孔中, 培養4—6h后換成含10%FBS的M199培養基。轉染后24h, 收取細胞樣品或進行感染實驗。對于感染實驗, 吸除細胞上清, 細胞用無血清M199輕輕洗一次, 加入MOI=0.5的SVCV病毒液, 20℃孵育1h后, 換成含2%FBS的M199培養基,分別收取感染后12h、24h和36h樣品進行病毒滴度測定、RT-qPCR檢測及蛋白免疫印跡。

1.7 Pdcd6ip蛋白過表達對細胞活性的影響測定

利用細胞增殖/毒性檢測試劑CCK-8 (cell counting kit-8)檢測Pdcd6ip過表達對細胞活性影響,具體操作步驟如下: 轉染前一天, 鋪104個EPC細胞至96孔細胞培養板中, 第2天待形成單層細胞時轉染重組質粒pCI-pdcd6ip和空載體pCI-neo, 每組3個復孔, 重復3次; 在轉染后24h、48h和72h分別向每孔加入10 μL的CCK-8試劑, 孵育1h時后利用酶標儀測定450 nm處的吸光度。

1.8 蛋白免疫印跡 (Western blot)

細胞用PBS洗2次, 每次3min, 加入RIPA細胞裂解液, 用槍吹打數下, 使裂解液和細胞充分接觸, 冰上孵育10min, 將裂解液轉移到1.5 mL EP管中,12000×g, 離心5min, 收集離心上清進行SDS-PAGE,并轉印至PVDF膜上。用5% PBST-BSA封閉液37℃封閉2h后加入對應的一抗 (1∶1000稀釋), 37℃孵育2h; PBST洗3次, 每次5min; 加入辣根過氧化物酶 (HRP)標記的二抗 (1∶5000稀釋), 37℃孵育1h;PBST洗3次, 每次5min; 使用ECL發光底物進行化學發光。

1.9 間接免疫熒光 (IF)

細胞用PBS洗2次, 然后加入4%的多聚甲醛室溫固定30min; 吸除固定液, 用PBS洗細胞3次, 加入含0.2% Triton X-100的PBS透化15min; PBS洗3次,加入含4% BSA的封閉液37℃孵育2h; 吸除封閉液,加入用封閉液稀釋的一抗 (兔抗SVCV M蛋白抗體,本實驗室制備[15], 以體積比1∶1000稀釋), 37℃孵育2h; PBS洗3次, 加入Alexa Fluor 488熒光標記的驢抗兔二抗 (體積比1∶2000稀釋), 37℃孵育1h; PBS洗3次, 每次3min, 加入PBS稀釋的染核液DAPI(1∶2000)染色液, 室溫染色10min, PBS洗3次, 每次3min; 最后置于Olympus-IX73熒光倒置顯微鏡下觀察和拍照。

1.10 熒光定量PCR (RT-qPCR)

重組質粒pCI-pdcd6ip和空載體pCI-neo轉染EPC細胞24h后, 用無血清M199洗細胞兩次, 以MOI=0.5接種SVCV, 20℃吸附1h, 換成含2%FBS的M199培養基; 于感染后12h、24h和36h分別收取實驗組和對照組樣品, 提取RNA并反轉錄合成cDNA; 利用熒光定量PCR方法進行病毒拷貝數測定[16]。在200 μL熒光PCR反應管中依次加入10 μL TB Green Premix ExTaqII, 濃度10 μmol/L正向引物、反向引物各0.4 μL, 0.4 μL ROX reference dye II和待測樣品cDNA 2 μL, 補充雙蒸水至20 μL, 置于7500Fast熒光定量PCR儀中進行反應, 反應條件為95℃ 30s; 之后95℃ 3s、60℃ 30s、72℃ 30s 40個循環, 在結束后, 立即由儀器進行熔解曲線分析, 最后通過ABI 7500 2.0.6軟件計算擴增產物Tm值[17]; 將轉染空載體pCI-neo的細胞12h M基因拷貝數設為1進行統計分析。

1.11 空斑實驗

將EPC細胞接于12孔細胞培養板中, 第2天形成細胞單層后用無血清的M199洗2次, 將病毒加入各孔 (500 μL每孔), 每種做3個重復。20℃吸附1h后, 吸除病毒液, 用含5%FBS和1.5%甲基纖維素的M199培養基輕輕覆蓋。培養72h后, 棄去培養基,細胞用4%多聚甲醛固定30min, 并用0.5%結晶紫染液室溫靜置染色30min, 吸除染液沖洗干凈, 待晾干后觀察結果。

2 結果

2.1 鯉pdcd6ip基因的克隆

目前, 公共數據庫中尚無確定的鯉pdcd6ip基因序列, 僅有斑馬魚pdcd6ip基因序列和其他魚類該基因的預測序列。本研究根據GenBank數據庫中斑馬魚pdcd6ip基因序列以及鯉、鯽、金線鲃、黑頭軟口鰷等預測的pdcd6ip基因序列的保守區設計了pdcd6ip基因特異性引物, 以鯉組織cDNA為模板進行PCR擴增, 擴增出了與目的條帶大小一致的約2610 bp的特異性基因片段。將該基因片段進行克隆、測序和序列比對, 結果顯示該片段確屬于鯉pdcd6ip基因。進一步序列比對顯示鯉pdcd6ip基因與預測的黑頭軟口鰷基因相似性最高, 為99.05%,其ORF區編碼869個氨基酸。蛋白質同源分析(圖 1)顯示, Pdcd6ip在魚類和哺乳動物中各自聚為一支,但相對保守, 具有較高的同源性。鯉Pdcd6ip與人和小鼠Pdcd6ip氨基酸序列相似性分別為71.07%和69.82%。

圖1 基于Pdcd6ip氨基酸序列構建的系統進化樹Fig. 1 The phylogenetic tree based on Pdcd6ip amino acid sequences

2.2 真核表達載體pCI-pdcd6ip的構建

將pdcd6ip基因ORF區克隆至真核表達載體pCI-neo, 構建pCI-pdcd6ip重組質粒。將重組質粒進行NheI和EcoR I雙酶切鑒定, 凝膠電泳結果顯示,重組質粒經雙酶切后獲得約5460和2610 bp的兩條特異性條帶, 與預期大小相符。進一步, 雙向測序結果表明構建的重組質粒序列正確無誤。

2.3 Pdcd6ip蛋白多克隆抗體的制備及其過表達的western blot驗證

目前, 針對魚類Pdcd6ip蛋白尚無特異性的商業化抗體, 因此, 本研究首先通過PCR擴增了pdcd6ip基因的ORF區, 并將其克隆至pRSET-A原核表達載體中, 構建了原核表達質粒pRSET-pdcd6ip, 重組質粒轉化大腸桿菌BL21(DE3)pLysS感受態細胞, 并在37℃, 1 mmol/L IPTG條件下進行Pdcd6ip蛋白的誘導表達(圖 2a), 純化蛋白并免疫實驗動物, 獲得了Pdcd6ip蛋白的多克隆抗體。如圖 2b所示, western blot檢測顯示在分子量約95 kD處出現特異性條帶, 與pdcd6ip基因編碼蛋白預測分子量大小一致, 說明制備的抗體能特異性的識別Pdcd6ip蛋白。接下來, 利用western blot檢測pCI-pdcd6ip質粒轉染EPC細胞后24h Pdcd6ip蛋白的表達情況(圖 2c), EPC細胞中存在較低水平的Pdcd6ip蛋白本底表達, 與轉染空載體pCI-neo的對照組相比, pCI-pdcd6ip轉染細胞中Pdcd6ip表達水平顯著上調, 表明該質粒能夠在轉染細胞中正確表達。

圖2 Pdcd6ip蛋白過表達的western blot驗證Fig. 2 Verification of the expression of Pdcd6ip in transfected EPC cells

2.4 Pdcd6ip蛋白過表達對細胞活性影響的測定

已有的研究報道表明, Pdcd6ip蛋白在調控細胞程序化死亡中起重要作用[4]。為明確其過表達對細胞活性的影響, 本研究首先利用RT-qPCR方法測定了過表達載體pCI-pdcd6ip在EPC細胞中的轉染效率, 結果表明, 轉染后24h, EPC細胞中pdcd6ipmRNA相對表達水平提高了約326倍 (圖 3a)。此外,在轉染后不同時間, 我們還利用CCK-8試劑測定了Pdcd6ip過表達對EPC細胞活性的影響。結果顯示, 與對照組相比, 在轉染后24h、48h和72h Pdcd6ip過表達組細胞活性均與對照組無顯著差異(圖 3b)。

圖3 轉染EPC細胞中pdcd6ip mRNA相對表達水平及Pdcd6ip過表達對EPC細胞活性影響的測定Fig. 3 The mRNA expression of pdcd6ip in EPC transfected cells and the effect of its overexpression on the viability of EPC cells

2.5 Pdcd6ip過表達對SVCV增殖的影響

為進一步研究Pdcd6ip蛋白對SVCV感染的影響, 我們利用本實驗室已制備的針對SVCV M蛋白的抗體[15], 對轉染后感染EPC細胞進行免疫熒光檢測。結果表明, 與對照組相比, Pdcd6ip過表達后SVCV感染細胞 (綠色)的數量顯著減少 (圖 4a)。我們對轉染后感染的細胞進行western blot檢測(圖 4b),pCI-pdcd6ip轉染細胞中Pdcd6ip蛋白表達水平升高,但M蛋白的表達水平明顯降低。我們還利用RT-qPCR檢測了M基因拷貝數, Pdcd6ip過表達后, M基因的拷貝數下降約70% (圖 4c)。此外, 我們還用空斑實驗檢測了轉染后SVCV感染12h、24h和36h病毒增殖滴度, 結果同樣表明, Pdcd6ip的過表達對病毒滴度有明顯抑制作用 (圖 4d)。綜合以上結果表明, Pdcd6ip過表達顯著抑制了SVCV的增殖。

圖4 Pdcd6ip過表達抑制SVCV的增殖Fig. 4 Pdcd6ip overexpression inhibited SVCV infection

3 討論

SVCV宿主范圍十分廣泛, 可以感染多種淡水魚類并引起暴發性鯉春病毒血癥, 是淡水魚養殖場重點防控的疫病病原。自首次分離報道以來[18], 其流行范圍不斷擴展, 目前全世界幾十個國家和地區都有SVCV的分離報道[19]。自1998年英國從我國進口的觀賞魚中檢測到SVCV以來, 其在我國多個省市均有檢出[20—23]。根據農業部《2019年我國水生動物重要疫病狀況分析》的數據, 我國2004、2016和2017—2018年都發生過SVC疫情[24], 造成了巨大的經濟損失。然而, 目前, 針對SVC尚無有效的疫苗或藥物, 唯一有效的措施即開展病原的密切監測,并對陽性樣品進行隔離或撲殺。因此, 對宿主抵抗SVCV感染機制的研究并開發出特異的抗病毒藥物對于SVCV的防治具有十分重要的意義。

Pdcd6ip蛋白是細胞內多泡體轉運系統的重要因子, 在細胞膜受體內吞和再循環中起到了關鍵作用[25]。然而, 迄今為止, 尚未見其在水生病毒感染中功能的研究報道。我們首次克隆了魚類pdcd6ip基因, 制備了其特異性的多克隆抗體, 并進一步研究發現Pdcd6ip過表達能顯著抑制SVCV的復制, 但其作用機制還尚不明確。利用生物信息學手段, 我們預測發現SVCV M蛋白含有可以與Pdcd6ip直接互作的PPxY結構域, 推測Pdcd6ip 也可以與M蛋白直接互作, 進而影響病毒的出芽過程。多種有包膜病毒中的研究表明病毒粒子的裝配及釋放需要特定ESCRT體系的參與, ESCRT體系包括5種復合體(ESCRT-0、 -Ⅰ、 -Ⅱ、 -Ⅲ 和 Vps4 復合體)及多種附屬蛋白。病毒蛋白通過晚期結構域PT/SAP、PPXY或LYPXnL與Pdcd6ip直接結合, 招募ESCRT蛋白, 進而轉運入多囊泡體(Multivesicular bodies, MVB)。然而, 病毒復制過程本身并不需要Pdcd6ip的參與[11]。我們研究發現Pdcd6ip抑制SVCV的復制, 這與多數有包膜病毒中研究發現并不一致, 提示Pdcd6ip在SVCV復制循環中的作用機制與HIV、DENV等病毒中的機制并不相同。最新研究表明Pdcd6ip為多功能蛋白, 除可以與ESCRT-Ⅰ和ESCRT-Ⅲ成員互作參與病毒出芽及MVB分選外, 還參與了一系列重要細胞過程, 包括MVB的分裂和融合、細胞內吞、細胞表面信號的轉導、內吞復合體的重分布、細胞運動和細胞黏附、細胞凋亡和JNK信號通路的調控等[9]。我們前期研究發現SVCV復制受到細胞骨架和酪氨酸激酶的調控[26], 而Pdcd6ip能夠顯著影響這些生物過程[9]。因此, 我們推測Pdcd6ip可能通過影響細胞骨架的時空分布或酪氨酸激酶的活性從而抑制SVCV的復制。此前, EIAV中同樣觀察到Pdcd6ip的過表達抑制其復制, 且EIAV晚期蛋白可以與Pdcd6ip及AP-2(早期內吞體關鍵蛋白)互作[12]。因此, 不排除Pdcd6ip過表達競爭性抑制了SVCV晚期蛋白與其他關鍵宿主蛋白的互作, 從而抑制了病毒的復制。

目前, 通過養殖魚類機體自身來防控病毒病的方法主要有以下兩種方式: 針對性的疫苗和生物制劑。水產疫苗是防治水生動物病毒性疾病比較有效的方法, 但目前僅開發了少數魚類病毒性疾病的疫苗。我國魚用疫苗研究更加相對滯后, 僅2011年草魚出血病活疫苗 [獸藥生字(2011)190986021]等投入了生產和使用。目前尚無商業化SVCV疫苗,且SVCV基因變異較為迅速、毒株間序列差異較大, 大大限制了SVCV疫苗在生產實踐中的應用前景。多肽類生物制劑具有較高的特異性, 且容易降解無殘留、不會產生耐藥性, 在綠色農業發展中具有良好的技術優勢, 但已有的產品比較局限, 實際水產生產中應用還較少。我們發現Pdcd6ip并不顯著影響細胞的增殖活性, 提示其可以作為功能性生物制劑開發的作用靶點。當然, 相關制品的開發有待進一步的體內實驗證據。

總之, Pdcd6ip在多種病毒的感染復制過程中發揮了重要的作用, 本研究構建了鯉Pdcd6ip真核表達載體并在EPC細胞中獲得了高水平表達, 并且發現其過表達對SVCV的感染具有顯著的抑制作用, 同時不影響細胞的正常活性。本研究結果為深入研究鯉Pdcd6ip蛋白的抗病毒機制提供了實驗依據, 并為水生病毒性疾病的預防和治療提供了新的研究思路。