尖形碘泡蟲(黏體門: 碘泡蟲科)的重描述及其分子系統(tǒng)學研究

石小威 王 茂 陳鴻真 高 磊 劉曉聰 楊承忠 趙元莙

(重慶師范大學生命科學學院, 重慶市動物生物學重點實驗室, 重慶401331)

黏孢子蟲(Myxosporeans)是一類個體微小、形態(tài)簡單且分布廣泛的后生動物寄生蟲, 主要寄生于魚類, 少數寄生于兩棲類、爬行類、鳥類和哺乳類[1—3]。迄今已記錄的黏孢子蟲有2600余種[4]。碘泡蟲科(Myxobolidae Thélohan, 1892)是黏孢子蟲中最大的一科, 包含碘泡蟲屬(MyxobolusBütschli,1882)、單極蟲屬(ThelohanellusKudo, 1933)和尾孢蟲屬(HenneguyaThélohan, 1892)等, 其中碘泡蟲屬是該科中物種最豐富的屬, 約有900種之多[5]。黏孢子蟲早期的分類主要基于孢子形態(tài), 然而后來大量的研究表明, 經典分類學很難對形態(tài)相似種進行有效區(qū)分, 特別是當其宿主特異性和組織趨向性極其相似的情況下, 鑒定工作尤為困難[6—9]。近30年來,分子生物學方法的介入, 為黏孢子蟲分類學的發(fā)展起到了極大的促進作用, 解決了諸多經典分類學未能妥善處理的問題, 厘清了過去一些類群劃分和物種鑒定的遺留問題[8,10,11]。然而在全世界所記錄的黏孢子蟲中, 僅有約23%的物種具有分子序列數據,因此仍有大量已知種的分子信息亟待補充和完善[4]。

鯽(Carassius auratusLinnaeus)具有生長速度快、繁殖能力強、肉質鮮美和營養(yǎng)價值高等特點,是我國重要的淡水養(yǎng)殖魚類[12]。同時, 鯽也是黏孢子蟲病發(fā)生率較高的經濟魚類之一, 據統(tǒng)計, 寄生于鯽的碘泡蟲就達64種之多[13—15], 其中包含尖形碘泡蟲Myxobolus acutusWu and Chen, 1987。尖形碘泡蟲由吳灶和與陳啟鎏在湖北五湖發(fā)現并命名, 其宿主為鯽, 寄生部位為腎和鰓[16]。因條件限制, 當時并未提供分子序列信息。本研究在嘉陵江重慶段檢獲尖形碘泡蟲, 宿主為鯽, 寄生部位為鰓和膽囊, 這是續(xù)發(fā)現該物種30余年以來的第一次記錄。本研究首次提供了尖形碘泡蟲的18S rDNA及ITS1序列, 并基于形態(tài)和分子信息對其進行重描述的基礎上, 開展了分子系統(tǒng)學研究, 以期為人們進一步了解該寄生蟲的進化生物學特征及魚類病原鑒定積累基礎資料。

1 材料與方法

1.1 樣本采集與物種鑒定

2015年4月、2018年4月和2019年5月在嘉陵江重慶段共采集鯽76尾。活體送往重慶市動物生物學重點實驗室用過量的MS-222麻醉劑(350 mg/L)進行安樂死, 隨后剖檢, 用肉眼檢查體表、鰓、肌肉、肝胰臟、腸、脾臟、心臟、膽囊、腎臟、膀胱等部位是否有明顯病癥及黏孢子蟲孢囊, 鏡檢各組織器官涂片中分散孢子的存在。后對獲取的黏孢子蟲新鮮樣本直接進行圖像采集(圖 1)及基因組DNA提取等工作, 對黏孢子蟲樣本的處理和種類鑒定參照文獻[12]進行。

圖1 尖形碘泡蟲重慶株系孢子形態(tài)Fig. 1 Morphology of Myxoblus acutus of Chongqing strain

1.2 DNA提取與PCR反應

DNA提取將從宿主鯽的鰓部獲得的黏孢子蟲孢囊用鑷子小心地剝離至1.5 mL離心管中, 用滅菌后的解剖針戳破后立即挑取部分孢子鏡檢, 顯微拍照, 剩下的孢子分散于盛有滅菌雙蒸水的離心管中, 離心富集, 懸浮洗2—3次以除去雜質。從宿主膽囊中檢獲的黏孢子蟲立即鏡檢, 顯微拍照, 剩余膽汁保存于1.5 mL離心管中, 從離心管中吸取10 μL含有孢子的膽汁, 用滅菌后的雙蒸水清洗2—3次,除去雜質。按照DNeasy Tissue Kit(QIAGEN, Germany)試劑盒的使用說明書對黏孢子蟲基因組DNA進行提取, 用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測,將獲得的基因組DNA溶液在-20℃條件下保存?zhèn)溆谩Ａ硗? 按照海洋動物組織 DNA提取試劑盒(TIANGEN, China)的說明書對宿主魚基因組DNA進行提取, 用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測, 將獲得的宿主魚基因組DNA溶液在-20℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

PCR反應對提取成功的黏孢子蟲樣本基因組DNA進行18S rDNA序列片段擴增, 擴增引物為18E: 5′-CTGGTTGATCCTGCCAGT-3′和18R: 5′-CTACGGAAACCTTGTTACG-3′[17,18]。20 μL的PCR反應體系: 引物各0.5 μL, 模板DNA 5 μL, Mix(上海英濰捷基生物公司)5 μL, 然后添加超純水補至20 μL; 反應程序為: 94℃預變性90s, 94℃變性20s, 56℃退火20s, 72℃延伸2min, 循環(huán)35次, 最后72℃再次延伸5min, 反應完成后于PCR儀12℃條件下保溫。將PCR反應產物通過1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測, 然后將有目的條帶的PCR產物用膠回收試劑盒Gel Extraction Kit(OMEGA, America)純化回收。將每個回收產物插入pMD18-T載體(TaKaRa,Japan), 隨后導入大腸桿菌(Escherichia coli)中進行單克隆培養(yǎng), 將2個克隆子送英濰捷基(上海)生物公司測序。黏孢子蟲ITS1序列擴增引物為28S1R: 5′-GTGTTTCAAGACGGGTCG-3′和ERIB10-V: 5′-CCGTAGGTGAACCTGCGGAAG-3′, 采用上述相似的方法進行PCR擴增。宿主魚的COI基因部分序列的PCR擴增參照文獻[19]。

1.3 序列分析與系統(tǒng)發(fā)育

序列分析樣本序列與相似度較高物種序列之間的遺傳距離用MEGA6.0軟件在K2P模型下計算獲得。序列相似度借助在線軟件Pairwise Sequence Alignment (網址: www.ebi.ac.uk/Tools/psa/)基于Global Alignment模式計算獲得。序列間變異位點采用Bioedit軟件分析。

系統(tǒng)發(fā)育分析用于構建系統(tǒng)發(fā)育樹的黏孢子蟲18S rDNA序列共有66條, 其中包括本研究得到的1條尖形碘泡蟲代表序列和65條與尖形碘泡蟲相似度較高的序列(通過NCBI在線BLAST結果),包括碘泡蟲、單極蟲、尾孢蟲等。另外, 選用Tetracapsuloides bryosalmonae(KF731712)和Buddenbrockia plumatellae(AY074915)為外群。利用在線軟件The CIPRES Science Gateway V.3.3 (網址: http://www.phylo.org/)中的RAxML-HPC2 XSEDE(8.2.12)模式構建最大似然樹(Maximum likelihood,ML), 并選擇1000次自舉(Bootstrap)重復檢測。利用MrBayes 3.1.2軟件構建貝葉斯樹(Bayesian inference, BI), 位點變異設置為invgamma分布, 序列最佳進化模型為GTR+I+G(通過Model test 3.7計算獲得), 運行10000000代, 每200代抽樣1次, 在舍棄25%的老化樣本后, 根據剩余樣本構建一致樹。系統(tǒng)樹的繪制由FigTree v1.4.2和Photoshop共同完成[20]。

1.4 主成分分析

基于成熟孢子的孢子長、孢子寬、大極囊長、大極囊寬、小極囊長和小極囊寬的測量值, 利用PAST3進行主成分分析(PCA), 以分析尖形碘泡蟲7個株系間的形態(tài)差異。使用變量協(xié)變矩陣生成具有95.0%置信的散點圖。

2 結果

基于形態(tài)及COI基因測序(GenBank登錄號:MZ769123)鑒定宿主魚為鯽。本實驗共發(fā)現7尾鯽感染尖形碘泡蟲(感染率為9.2%), 其中6尾感染部位為鰓, 均形成乳白色圓形孢囊(直徑為1—2 mm),1尾感染部位為膽囊, 孢子游離于膽汁中, 未形成孢囊。本文將從上述感染宿主中獲得的尖形碘泡蟲分離株稱為株系, 共得到7個分離株即S1—S7株系,整體稱為重慶株系。

2.1 尖形碘泡蟲Myxobolus acutus Wu and Chen,1987重慶株系形態(tài)學描述

尖形碘泡蟲重慶株系成熟孢子殼面觀呈梨形,前端稍尖, 后端鈍圓, 縫面觀呈寬紡錘形(圖 1)。孢子長(13.6±0.9) μm [(11.4—15.3) μm](n=175), 寬(10.2±0.9) μm [(7.5—12.8) μm](n=175), 厚(7.6±0.6) μm[(6.9—8.3) μm](n=5)。兩梨形極囊開口處緊靠并位于孢子前端, 極囊大小不等, 大極囊長(6.2±0.4) μm[(5.1—7.5) μm](n=175), 寬(3.8±0.4) μm [(2.8—4.7) μm](n=175), 極絲盤繞5—8圈, 小極囊長(2.7±0.4) μm[(1.7—3.7) μm](n=175), 寬(1.4±0.2) μm [(0.9—1.9) μm](n=175), 極絲盤繞2—3圈。尖形碘泡蟲重慶7株系形態(tài)與原始描述相符(圖 1和表 1)[16]。通過比較發(fā)現, 與尖形碘泡蟲形態(tài)較相似的種有微孢碘泡蟲(Myxobolus microsporesLi and Nie, 1973)、葡萄碘泡蟲(Myxobolus acinosusNie and Li, 1973)和異樣碘泡蟲(Myxobolus diversusNie and Li, 1973)。與微孢碘泡蟲相比, 尖形碘泡蟲的孢子略大(11.3—15.5 μmvs.9.6—12.0 μm)。葡萄碘泡蟲孢子呈茄形, 前端狹窄而稍彎, 這與尖形碘泡蟲的梨形孢子前端略尖且不彎曲的形態(tài)有所不同。異樣碘泡蟲的孢子比尖形碘泡蟲稍大(13.2—16.8 μmvs. 11.3—15.5 μm),且大極囊長約占孢子長的1/3, 而尖形碘泡蟲的大極囊長約占孢子長的1/2(表 1)[21]。

表1 尖形碘泡蟲與相似種的形態(tài)學比較Tab. 1 Morphological comparison of Myxobolus acutus with its similar species (μm)

主成分分析結果顯示, 本研究所檢獲的尖形碘泡蟲7株系間(S1—S7)孢子形態(tài)量度無顯著差異(圖 2)。

圖2 尖形碘泡蟲重慶各株系主成分分析Fig. 2 Principal component analysis (PCA) for Myxobolus acutus of Chongqing strains

2.2 尖形碘泡蟲18S rDNA分子特征及系統(tǒng)發(fā)育分析

獲得尖形碘泡蟲S1—S7株系18S rDNA序列片段長度分別為1851 nt(GenBank登錄號: MZ782721)、1932 nt(GenBank登錄號: MZ782722)、1896 nt(GenBank登錄號: MZ782723)、1871 nt(GenBank登錄號: MZ782724)、1810 nt(GenBank登錄號: MZ 782725)、1677 nt(GenBank登錄號: MZ782726)和1839 nt(GenBank登錄號: MZ782727)。7株系間序列相似度為100%, 遺傳距離為0, 變異位點0個, 即7株系18S rDNA序列為同一基因型。尖形碘泡蟲18S rDNA序列與GenBank數據庫中的中華單極蟲(Thelohanellus sinensis, KY469292)相似度最高(95.4%), 遺傳距離最小(0.047), 其次為蒼梧碘泡蟲(Myxobolus tsangwuensis, KJ561441; 93.6%, 0.081)和貝殼碘泡蟲(Myxobolus musseliusae, FJ710801;93.2%, 0.080)。

本研究獲得株系S1、S5和S6的ITS1序列, 長度分別為298、318和318 nt。序列分析結果顯示, 株系S5與株系S6共享同一基因型, 該基因型與株系S1的基因型序列差異較大, 差異位點數有168個(圖 3)。

圖3 尖形碘泡蟲S1、S5、S6三株系間ITS1序列分析Fig. 3 The site variation analysis of ITS1 sequences for the three strains (S1, S5 and S6) of Myxobolus acutus

本研究構建的ML樹和BI樹拓撲結構一致(圖 4)。系統(tǒng)樹聚為三大支系, 其中進化支Clade Ⅰ處于系統(tǒng)樹的基部位置, 后依次為Clade Ⅱ和Clade Ⅲ進化支。尖形碘泡蟲位于Clade Ⅲ支系中Subclade A亞支: 尖形碘泡蟲與中華單極蟲(KY469292)聚為一支, 該支與貝殼碘泡蟲(JQ040301)、蒼梧碘泡蟲(KJ561441)和鰓基碘泡蟲(AF507971)形成的進化支呈姐妹群關系(圖 4)。

圖4 基于18S rDNA序列構建的ML/BI樹Fig. 4 ML/BI phylogenetic tree based on the 18S rDNA sequences

3 討論

本研究獲得的尖形碘泡蟲孢子形態(tài)符合原始描述。宿主鯽的膽囊為尖形碘泡蟲的感染部位新記錄, 重慶地區(qū)為地理新分布。原始報道的尖形碘泡蟲僅以游離孢子的形式存在, 而本研究發(fā)現該物種可以形成孢囊。尖形碘泡蟲重慶各株系間成熟孢子形態(tài)相似, 主成分分析結果進一步表明各株系間孢子形態(tài)量度無顯著差異, 應為同一物種。同時,7株系間18S rDNA序列無差異, 進一步證實這些株系為同一物種。

以往的研究表明, ITS1是研究物種種內關系的理想分子標記, 在不同生物類群中得到了廣泛應用[22—27], 而在黏孢子蟲類群中的相關應用則很少[28—30]。本研究分別獲得了尖形碘泡蟲S1、S5和S6株系的ITS1序列。序列分析顯示, S5和S6共享1個基因型, 該基因型與S1的序列存在很大差異(共有168個差異位點)。這表明尖形碘泡蟲在嘉陵江重慶段江域具有一定程度的遺傳多樣性水平, 并且S1可能與S5和S6有著不同的遺傳來源。

本研究系統(tǒng)發(fā)育分析顯示, 處于分化較早支系的寄生蟲其寄生部位表現出了較高的一致性, 如Clade Ⅰ物種的寄生部位均為肌肉, Clade Ⅱ物種的寄生部位均為鰓。而分化較晚的Clade Ⅲ支系, 雖然沒有完全表現出寄生部位的高度一致性, 但在一些小的進化亞支中的物種仍有較為一致的寄生部位(圖 4)。這表明, 碘泡蟲科物種的系統(tǒng)發(fā)育與其寄生部位有著較為密切的關系。在碘泡蟲科物種進化過程中, 逐漸由原來的寄生部位高度一致性向多寄生部位演化, 在分化最晚的Clade Ⅲ進化支中即出現了一些物種具有多寄生部位的現象(圖 4)。從進化角度來看, 在一個支系中大多數物種共有的寄生部位應是初始寄生部位, 其他的則是后來適應的新寄生部位。如Subclade A進化亞支中, 物種均寄生于鰓部, 而其中的尖形碘泡蟲不僅可寄生于鰓,還可寄生于膽囊(圖 4), 從系統(tǒng)發(fā)育與寄生部位演化的角度推測, 尖形碘泡蟲的初始寄生部位應為鰓,而膽囊則是其后來適應的新的寄生部位。