童方樂 唐 濤 魏澤宏 胡 毅 劉少軍
(1. 湖南師范大學生命科學學院, 省部共建淡水魚類發育生物學國家重點實驗室, 長沙 410081;2. 湖南農業大學動物科技學院, 長沙 410125)
苜蓿(Medicago sativaL.)是一種多年生豆科植物, 具有產草量高、適應性廣、營養豐富等特點。其資源豐富, 素有“牧草之王”之稱, 我國每年苜蓿總產量8×109kg[1,2]。苜蓿粗蛋白含量較高, 為12.3%—26.1%, 符合飼料蛋白質要求[3]。苜蓿草粉包含20多種氨基酸, 其氨基酸組成均衡, 包括人和動物全部必需氨基酸及稀有氨基酸, 如瓜氨酸和刀豆氨酸等[4]。苜蓿草粉還含有各種維生素, 如葉酸、維生素K和維生素E等[3], 可滿足動物生長的營養需求。此外, 苜蓿中含有的類胡蘿卜素、皂苷、黃酮類和苜蓿素等生物活性成分具有抗氧化作用[1,5]。Yin等[6]研究了發酵苜蓿草粉替代豆粕對鵝血清抗氧化酶活力的影響, 發現鵝血清抗氧化酶活性隨苜蓿草粉添加量的提高而升高。在資源緊缺的當下,苜蓿作為一種營養豐富、產量富足的植物資源, 可考慮作為水產動物飼料原料使用。然而目前關于苜蓿在魚類飼料中使用的報道并不多, 且多集中在苜蓿對魚類生長性能的影響這一方面, 如馬晶晶等[7]研究了紫花苜蓿濃縮葉蛋白替代魚粉對星斑川鰈幼魚(Platichthys stellatus, Pallas, 1788)生長的影響,發現紫花苜蓿濃縮葉蛋白替代魚粉的比例為19.0%時, 星斑川鰈幼魚獲得最佳生長。宋堅等[8]研究了苜蓿草粉對刺參幼參(Apostichopus japonicus)生長的影響, 結果表明當苜蓿草粉的添加比例為10%時,刺參有最高的特定生長率和最低的餌料系數。關于苜蓿對魚類肌肉品質的研究較少。魚類肌肉品質評價內容主要包括營養成分、感官特征和質構特性等方面[9]。胡喜峰等[10]研究了不同水平苜蓿草粉對團頭魴(Megalobrama amblycephala)生長性能及肉品質的影響, 主要集中在形體指標和肌肉營養成分方面, 沒有對肌肉的質構特性等進行報道。
草魚(Ctenopharyngodon idella)是我國淡水養殖規模最大和養殖區域最廣的魚類品種[11], 由于生長速度快, 肉味鮮美, 受到廣大消費者的喜愛, 其飼料在全球水產飼料使用量中占據著較高的地位[12]。作為一種典型的草食性魚類, 草魚在自然生長過程中會以水草和一些植物性餌料為食, 因此在草魚飼料中添加苜蓿具有較大的研究價值。隨著社會生活水平的提高及水產業的發展, 人們對水產食品的安全性以及魚肉品質的關注度越來越高。因此, 本試驗選取草食性魚類草魚作為研究對象, 在研究苜蓿對其生長和血清抗氧化指標影響的同時, 檢測其肌肉品質變化, 為苜蓿在草魚飼料中的應用提供理論基礎。
本試驗以豆粕、魚粉和菜粕為主要蛋白源, 以豆油為主要脂肪源, 在基礎飼料(對照組)中分別添加5%、10%、15%和20%的苜蓿粉, 配制成5種等氮等脂的飼料。試驗所用苜蓿來自中國農業大學涿州實驗站(中國河北)。飼料配方如表 1所示。各原料粉碎后過40目篩, 逐級混合后, 與大豆油混合,加水, 經實驗室擠壓機制成直徑2 mm的沉性顆粒飼料。所有的飼料置于60℃環境下烘干5 h后, 于塑料袋中密封保存, 并放置在-20℃冰箱中保存直至使用。

表1 飼料配方與基本營養成分分析Tab. 1 Formulation and proximate analysis of experimental diets
試驗在湖南省車田江水庫(湖南省婁底市)進行。從湖南省岳陽市湘陰縣引進草魚, 使用對照組飼料馴化1周后, 禁食24 h, 將初始體重(50.04±0.04) g的600尾草魚按照每個網箱40尾, 隨機分為15個網箱(1.5 m×1.5 m×2.0 m), 每個處理3個網箱。每天投喂3次(8: 00、12: 30和16: 00), 飽食投喂, 投喂周期為61d。試驗期間水質指標數據為: 水溫(26.0±3.3)℃、pH 7.3±0.5、溶解氧 (7.0±0.5) mg/L。
在試驗結束后, 草魚禁食24h, 用MS-222(間氨基苯甲酸乙酯甲磺酸鹽, Sigma, St. Louis, MO,USA)對草魚進行麻醉后計數并稱重。每個網箱隨機取3尾魚, 在測定體質量后, 用1 mL注射器從尾靜脈取血, 4℃過夜后用離心機(4℃, 3500 r/min)離心15 min, 收集上層血清, 用于測定血清生化指標; 取血后的草魚于冰盤上解剖, 取出內臟, 準確稱量肝胰臟和內臟團的重量。采集一側背鰭下方側線上方肌肉1 cm×0.5 cm×0.5 cm放置在冰上進行肌肉質地分析。采集另一側肌肉放入液氮罐中速凍后, 帶回實驗室儲存在-80℃的冰箱中用于肌肉營養成分分析和肌肉酶活分析。
生長指標測定根據測定的數據計算試驗魚的特定生長率(Specific growth rate,SGR)、飼料系數(Feed conversion ratio,FCR)、攝食率(Feeding rate,FR)、肝體比(Hepatosomatic index,HSI) 、臟體比(Viscerosomatic index,VSI)、肥滿度(Condition factor,CF), 根據統計的試驗魚存活情況計算成活率(Survival rate,SR), 計算公式如下:
特定生長率(SGR, %/d)=100%×[ln(實驗魚終末均重)-ln(實驗魚初始均重)]/天數
飼料系數(FCR)=總投飼量/實驗魚總增重量
攝食率(FR, %)=100%×總投飼量/(實驗魚初始總重+實驗魚終末總重)/2/投喂天數
肝體比(HSI)=100×(肝臟重/魚體質量)
臟體比(VSI)=100×(內臟重/魚體質量)
肥滿度(CF, g/cm3)=100×魚體質量/體長3
成活率(SR, %)=100%×(實驗末魚數量/實驗初魚數量)
肌肉和飼料基本營養成分分析按標準方法(AOAC, 2005)分析肌肉和飼料的營養成分。將肌肉樣品放置在105℃電熱恒溫干燥箱(DHG-9240A, 上海齊欣)中烘干至恒重以測定水分。粗蛋白含量通過凱氏定氮法(Kjeltec 2300, FOSS,Sweden)測定。脂肪測定采用索氏抽提法(Soxtec 2050, FOSS, Sweden)。采用過濾法(國標GB/T 6434-2006)測定飼料中粗纖維含量。
肌肉持水力和pH測定采用重量法[13]測失水率(Water loss rate)和失脂率(Lipid loss rate)。取1 g左右的去皮肌肉稱重(S), 用濾紙包裹(V1), 放入離心管中, 室溫下4000×g離心10min。將離心后的濕濾紙稱重(V2), 在烘箱中烘干至恒重(V3)。計算公式為: 失水率(%)=100%×(V2-V3)/S, 失脂率(%)=100%×(V3-V1)/S。
肌肉pH由pH計(Testo-205, testo AG, 德國)在室溫下根據已報道的研究[14]描述方法進行測定。
肌肉TBARS測定將已報道的研究方法[15]稍做修改后測定肌肉硫代巴比妥酸值(Thiobarbituric acid value)。將肌肉樣品(10 g)混合于20 mL三氯乙酸溶液[1∶5(W/V) ]中。在3500×g、4℃離心15min后, 取上清液。將5 mL上清液與5 mL 2-硫代巴比妥酸(TBA)溶液混合。同時以5 mL三氯乙酸和5 mL TBA混合液為空白溶液。樣品溶液和空白溶液均在沸水浴中加熱15min, 用自來水冷卻后, 在530 nm處測定樣品溶液(As)和空白溶液(Ab)的吸光度。TBA值(mg/100 g)為:TBA=50×(As-Ab)/200。
肌肉質地測定在已報道的研究基礎上[16]適當修改后進行肌肉質地測定, 使用TMS-PRO TPA裝置(Food Technology Corporation, USA), 該裝置配備有平底圓柱形探頭(直徑: 8 cm)和250 N的稱重傳感器。對肌肉樣品進行質地剖面分析(TPA)測量, 壓縮比為60%的雙重壓縮試驗。在試驗過程中探頭的運動速度為1 mm/s, 兩次壓縮間隔時間為2s。通過TPA模式檢測肌肉硬度、黏附性、內聚性、彈性、膠黏性和咀嚼性等質地特征。
血清和肌肉酶活測定使用南京建成生物工程研究所生產的試劑盒檢測血清過氧化氫酶(CAT; A007-1-1)、超氧化物歧化酶(SOD; A001-3-2)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX; A005-1-2)和丙二醛(MDA; A003-1-2)含量。
使用南京建成生物工程研究所生產的試劑盒檢測肌肉乳酸(A019-2-1)、羥脯氨酸(A030-2-1)、肌鈣蛋白T(H149-3)和糖原含量(A043-1-1)含量。稱取1 g左右肌肉樣品, 將其放入15 mL離心管中,在離心管中按質量體積比1∶9加入已經預冷的生理鹽水進行勻漿。在4℃ 3000×g下離心10min后取上清, 按試劑盒操作手冊進行檢測。
采用SPSS 18.0軟件進行統計分析。所有數據均以均數±標準誤表示, 并用單因素方差分析和Tukey’s檢驗不同投飼處理之間的差異。P<0.05作為判斷差異顯著性標準。
如表 2所示, 在飼料中添加苜蓿草粉后, 對草魚的存活率沒有顯著性影響(P>0.05)。與對照組相比, 15%苜蓿組的攝食率和飼料系數顯著高于對照組(P<0.05), 當飼料中苜蓿草粉添加量達到20%時,草魚的特定生長率顯著降低(P<0.05)。

表2 飼料中添加苜蓿草粉對草魚生長的影響Tab. 2 The effect of dietary alfalfa on the growth performance of grass carp
如表 3所示, 苜蓿對草魚的肝體比沒有顯著性影響(P>0.05)。除10%苜蓿組外, 添加不同含量苜蓿草粉顯著降低了草魚臟體比(P<0.05)。草魚肥滿度隨著苜蓿草粉添加水平升高而降低, 當添加量超過5%時, 出現顯著差異(P<0.05)。

表3 飼料中添加苜蓿草粉對草魚形體指標的影響Tab. 3 The effect of dietary alfalfa on body index of grass carp
如表 4所示, 在飼料中添加苜蓿草粉對草魚肌肉水分、粗蛋白、粗脂肪均無顯著影響(P>0.05)。

表4 飼料中添加苜蓿草粉對草魚肌肉常規養分組成的影響(%濕重)Tab. 4 The effect of dietary alfalfa on muscle nutrient composition of grass carp (% wet weight)
由表 5所示, 在飼料中添加苜蓿草粉對草魚肌肉內聚性、彈性、膠黏性和咀嚼性無顯著影響(P>0.05), 對草魚肌肉硬度和黏附性有顯著影響(P<0.05)。10%苜蓿組草魚肌肉硬度顯著高于對照組(P<0.05), 其余苜蓿添加組與對照組相比無顯著性差異(P>0.05)。除20%苜蓿組外, 其余苜蓿添加組肌肉黏附性顯著高于對照組(P<0.05), 20%苜蓿組肌肉黏附性與對照組相比無顯著性差異(P>0.05)。

表5 飼料中添加苜蓿草粉對草魚肌肉質構特性的影響Tab. 5 The effect of dietary alfalfa on muscle texture properties of grass carp
如表 6所示, 苜蓿對草魚的失脂率和pH均無顯著性影響(P>0.05)。在飼料中添加苜蓿草粉后顯著增加了草魚肌肉的失水率(P<0.05)。

表6 飼料中添加苜蓿草粉對草魚肌肉持水力和pH的影響Tab. 6 The effects of dietary alfalfa on water holding capacity and pH of grass carp muscle
如表 7所示, 隨著苜蓿草粉添加量的提高, 草魚肌肉硫代巴比妥酸值呈顯著下降趨勢(P<0.05)。

表7 飼料中添加苜蓿草粉對草魚肌肉TBARS含量的影響Tab. 7 The effect of dietary alfalfa on TBARS contents in muscle of grass carp
如表 8所示, 在飼料中添加苜蓿草粉后, 肌肉羥脯氨酸值有所上升, 10%和15%苜蓿組肌肉羥脯氨酸含量顯著高于對照組(P<0.05), 其余苜蓿添加組與對照組相比無顯著性差異(P>0.05)。在飼料中添加苜蓿草粉對肌肉糖原、肌鈣蛋白T含量無顯著性影響(P>0.05), 然而, 對肌肉乳酸含量有顯著性影響, 在飼料中添加苜蓿草粉后, 顯著降低了肌肉乳酸含量(P<0.05)。
如表 9所示, 20%苜蓿組血清CAT活力顯著高于對照組(P<0.05), 其余苜蓿添加組的血清CAT與對照組相比沒有顯著性差異(P>0.05)。15%和

表9 飼料中添加苜蓿草粉對草魚血清抗氧化的影響Tab. 9 The effect of dietary alfalfa on serum antioxidation of grass carp
20%苜蓿組血清MDA含量顯著低于對照組(P<0.05),5%和10%苜蓿組血清MDA含量與對照組相比無顯著性差異(P>0.05)。15%和20%苜蓿組血清GSHPX活力顯著高于對照組(P<0.05)。血清SOD活力在各組之間沒有顯著性差異(P>0.05)。
苜蓿粗蛋白含量較高, 維生素種類豐富, 礦物質含量高, 含有多種未知的生長因子及特殊的免疫活性蛋白——葉蛋白、皂苷、黃酮、多糖和膳食纖維等特殊營養功能成分[3]。紫花苜蓿適口性好,研究表明, 草魚離體內臟酶酶解紫花苜蓿的消化率為37.42%, 與胰蛋白酶對紫花苜蓿的消化結果相近, 并且研究發現在相同加酶量的情況下, 紫花苜蓿的消化率指數位于豆粕和玉米蛋白飼料之間, 說明紫花苜蓿具有良好的可消化性, 可用作水產飼料原料[17]。近年來, 關于苜蓿用于水產動物飼料的研究不多, 且試驗結果也不完全一致。Ali等[18]以尼羅羅非魚[Oreochromis niloticus, (12.38±0.39) g]為研究對象, 發現飼料中添加5%以上的苜蓿草粉后降低了魚體的生長性能。何云等[19]的研究表明, 在對照組飼料中添加5%和10%的苜蓿草粉后, 黃河鯉[Cyprinus carpio haematopterusTemminck et Schlegel, (248.70±1.31) g]的特定生長率和餌料系數均有所改善。張春梅等[20]以團頭魴(59.90 ±0.84) g為研究對象, 發現飼糧中添加16%紫花苜蓿草粉后可顯著改善其生長性能。在本試驗中, 添加15%苜蓿草粉后, 草魚飼料系數和攝食率顯著升高, 在添加20%苜蓿草粉后, 草魚特定生長率顯著降低。出現這一現象的原因可能有以下幾個方面。其一, 苜蓿的粗纖維含量較高。研究表明, 紫花苜蓿的粗纖維含量高達33.62%[17], 適量的纖維素在一定程度上能夠刺激消化道的蠕動和消化酶的分泌, 有利于食物的消化。然而, 當纖維素含量過高時將會導致腸道蠕動速度過快, 食物在還沒有被消化完全的情況下被排出體外, 食物消化率降低[21]。此外, 研究發現,草魚雖然是草食性魚類, 但缺乏與纖維素酶合成相關的基因[22]。高春生等[23]發現在草魚飼料中添加纖維素酶后可促進草魚生長, 降低飼料系數。本試驗添加較高水平的苜蓿草粉后草魚生長性能下降可能與苜蓿中含有較高的纖維素有關。其二, 苜蓿中含有抗營養因子, 如蛋白酶抑制劑、皂苷、單寧、抗維生素和植物雌激素等[24]。魚類攝取含蛋白酶抑制劑的飼料后可能降低魚類對飼料中蛋白質和氨基酸等營養物質的消化率, 使其日增重下降,飼料轉化率降低[25]。Krogdahl等[26]在虹鱒(Oncorhynchus mykiss)基礎飼料中添加不同水平的大豆蛋白酶抑制劑, 結果表明高劑量的大豆蛋白酶抑制劑顯著降低了虹鱒的腸道蛋白酶活性和蛋白質消化率。高劑量的皂苷對動物生長有抑制作用,Couto等[27]在金頭鯛(Sparus aurata)飼料中添加12 g/kg的大豆皂苷, 結果表明, 大豆皂苷在一定程度上抑制了金頭鯛的生長。單寧的抗營養性表現在其易與蛋白質等結合[28], 進而影響飼料中蛋白質等的消化吸收。Hay等[29]在小羚羊基礎飼料中添加單寧酸, 發現單寧酸組飼料蛋白質、粗纖維的消化率和能量利用率均比基礎飼料組低7%以上。
在飼料中添加苜蓿草粉后, 草魚的臟體比和肥滿度有所下降, 這與馬晶晶等[7]對星斑川鰈幼魚(Platichthys stellatus, Pallas, 1788)的研究結果一致,其研究表明, 紫花苜蓿濃縮葉蛋白替代魚粉的比例越高, 其肥滿度下降越明顯。
肌肉的質構特性是評價肌肉品質的重要指標之一。TPA主要通過模擬人體口腔的咀嚼運動, 獲得一系列參數, 以此來表示硬度、黏性、彈性、黏聚性、膠著性和咀嚼性等。本研究表明, 當飼料中苜蓿草粉添加量為10%時, 顯著提高了草魚肌肉硬度, 當苜蓿草粉添加量為5%—15%時, 顯著提高了草魚肌肉黏附性。研究表明, 肌肉的硬度等越大,肌肉的感官脆度也越大, 具有更好的口感[30]。本試驗中草魚肌肉硬度增大可能與肌肉中膠原蛋白含量增大有關。膠原蛋白含量對肌肉質地有顯著影響, 膠原蛋白含量越高, 硬度越高[6]。羥脯氨酸是膠原蛋白的特征性氨基酸, 通常將羥脯氨酸含量乘以8來評估膠原蛋白的含量[31]。在本試驗中, 10%和15%苜蓿組的肌肉羥脯氨酸含量顯著高于對照組,這可能是導致肌肉硬度、黏附性增大的原因之一。此外, 有研究表明, 魚體肌肉膠原蛋白含量越高則肌肉越堅實, 機械強度越高[32]。
在魚體死亡后, 糖原通過糖酵解途徑生成乳酸和ATP, 同時產生H+, 魚體pH降低, 導致魚肉蛋白質變性, 從而影響魚肉的品質[33]。本研究添加苜蓿草粉后草魚乳酸含量顯著性下降, 說明飼料中添加苜蓿后肌肉糖酵解過程減弱。這可能是因為苜蓿能夠抑制糖酵解過程相關酶的活性, 減弱糖酵解途徑, 進而延緩肌肉蛋白質變性。
持水力是評估魚肉品質的重要參數之一, 持水力的高低通常用失水率、汁液流失率等指標來評價[34]。在本研究中, 飼料中添加苜蓿草粉后, 草魚肌肉失水率顯著上升, 說明苜蓿能夠影響草魚肌肉的持水力, 使其持水力下降。研究表明, 持水力高的肌肉較鮮嫩; 持水力低, 肌肉中的水分蒸發, 營養物質被帶走, 肌肉就會表現為干硬, 肉質也有所下降[35]。研究表明[36]肌細胞外空隙、胞外總空隙 (包括肌束間空隙) 和液體流失有較好的相關性。Lawson等[37]報道鈣激活酶(Calpain)與流失通道的形成有一定的關系, 本研究添加苜蓿草粉后肌肉持水力下降可能與苜蓿草粉增加了鈣激活酶活性有關, 導致肌肉細胞間隙增大, 持水力下降, 但有待進一步研究。關于苜蓿對肌肉品質的影響, 在水產行業研究得較少, 在其他畜禽行業可見一些研究, 趙靜等[38]在豬飼料中分別添加5%、10%、15%和20%水平的苜蓿草粉, 結果表明各添加水平的苜蓿草粉均未對豬肉的pH和持水力產生顯著影響。陳文雪等[39]在羊的基礎飼料中分別用0、10%、20%、30%和40%的苜蓿草粉等量替代花生秧, 結果顯示, 各試驗組的pH與對照組接近, 但肌肉滴水損失下降, 嫩度提高。本試驗的試驗結果與其他試驗相比, 在pH方面的影響是一致的, 在肌肉持水力方面的影響不一致, 可能與試驗品種和試驗品種對苜蓿的消化有關。
硫代巴比妥酸值由脂肪的二級氧化產物丙二醛的量反映, 硫代巴比妥酸值越高, 說明脂肪氧化程度越高, 肌肉品質下降越嚴重[40]。草魚肌肉硫代巴比妥酸值隨飼料中苜蓿草粉添加量的增高呈顯著下降趨勢, 說明苜蓿能夠減緩脂質氧化速度, 進而延長肌肉儲存時間。這可能與苜蓿中含有苜蓿多糖、黃酮、維生素C和維生素E等抗氧化劑有關。研究證明, 多糖類和黃酮類能夠在一定程度上抑制肉糜制品中脂肪氧化, 使其硫代巴比妥酸值降低, 具有改善肉糜品質的作用[41]。廖嬋等[42]為研究維生素E對脂質抗氧化的作用, 將維生素E噴淋于干腌火腿切塊表面, 結果表明, 4個月后, 火腿的硫代巴比妥酸值下降了36%。張健凱等[43]的研究表明,維生素C能夠使豬肉腌制過程中的硫代巴比妥酸值降低。
CAT、SOD和GSH-PX都是機體重要的抗氧化酶類, SOD在生物體內廣泛存在, 它能夠平衡體內的氧自由基[44], 并生成H2O2; CAT主要存在于微粒中, 它能夠將SOD與超氧陰離子反應生成的H2O2分解為H2O和O2, 防止機體過氧化[45]; GSH-PX的主要作用是清除脂類氫過氧化物, 防止機體發生氧化損傷[46]; MDA是多不飽和脂肪酸過氧化的主要分解產物, 其含量多少可以間接反映出脂質過氧化程度[47]。在本試驗中, 苜蓿草粉的添加提高了血清GSHPX和SOD的活力, 降低了血清MDA含量, 這與王成章等[48]的研究一致, 其研究表明苜蓿草粉的添加使黃河鯉血清SOD和GSH-PX活力提高, MDA含量下降。本試驗添加苜蓿草粉后, 草魚血清過氧化能力提高可能與苜蓿草粉中含有類胡蘿卜素、黃酮、皂苷及多種維生素(如維生素C、維生素E等)有關[1]。類胡蘿卜素通過清除氧自由基, 保護細胞免受氧化損傷[49]。研究表明, 苜蓿葉總黃酮在一定的質量濃度范圍內具有較強的抗氧化活性, 并且其抗氧化活性隨其質量濃度的增加而增加[50]。苜蓿皂苷通過減少自由基合成的原料, 增加分解自由基的酶類物質進而提高機體的抗氧化能力[51]。維生素C的抗氧化作用依靠可逆的脫氫反應來完成, 其可以與HOO-及OH-反應生成半脫氫抗壞血酸[52]。維生素E通過向脂氧自由基或脂過氧自由基提供氫離子,使脂質過氧化鏈式反應中斷[53]。此外, 研究證明,膳食纖維也具有抗氧化作用, 膳食纖維可能是通過減少體內脂肪儲存, 進而減少脂質過氧化反應[54]。
綜上所述, 當飼料中苜蓿草粉的添加量不超過15%時, 對草魚生長性能沒有顯著性影響, 且能提高草魚肌肉品質和血清抗氧化能力。因此, 草魚飼料中苜蓿草粉的適宜添加量不應超過15%。