發酵豆粕替代魚粉對大口黑鱸幼魚生長、脂質代謝、血清非特異性免疫及腸道菌群的影響

黃 河 田鑫鑫 黃旭雄, 陳乃松, 鐘國防,

(1. 上海海洋大學水產科學國家級實驗教學示范中心, 上海 201306; 2. 上海海洋大學農業農村部魚類營養與環境生態研究中心, 上海 201306; 3. 上海海洋大學農業農村部淡水水產種質資源重點實驗室, 上海 201306)

大口黑鱸(Micropterus salmoides), 俗稱加州鱸,屬鱸形目(Perciformes)、太陽魚科(Cehtrachidae),為淡水肉食性魚類, 原產于北美洲。20世紀80年代人工繁殖成功后引入我國廣東省, 經過多年養殖發展, 目前已經成為我國淡水養殖的重要品種之一。但國內養殖加州鱸主要是以投喂冰鮮魚與配合飼料相結合的方式為主, 這種方式不僅容易污染水環境, 而且還容易暴發疾病, 故全程使用配合飼料是大口黑鱸產業可持續發展的必然趨勢。然而, 全球魚粉缺乏, 其資源已經無法滿足現代水產養殖業持續增長的需要[1], 對大口黑鱸等高魚粉飼料的影響最為顯著。因此, 尋求魚粉替代物已然成為當今水產動物營養研究的熱點問題[1,2]。

豆粕的蛋白質含量較高, 供應穩定且低廉[3], 被認為是較好的魚粉替代物。然而, 由于它含有許多抗營養因子, 包括蛋白酶抑制劑、凝集素、植酸、皂角苷、植物雌激素、抗維生素和致敏原[4,5], 在一定程度上會對營養物質的消化吸收產生抑制作用[6,7]。此外, 研究表明, 豆粕替代魚粉會誘導魚類的腸道微生物群失調[8], 過度替代還會誘發魚的腸炎、氧化應激和免疫功能障礙[9]等不良反應。而豆粕經微生物發酵后可以減少大多數抗營養因子, 降解大分子蛋白為小肽和水溶性化合物, 從而提高其營養價值并增強營養物質的消化率[10,11]。同時也可以為動物提供益生菌、益生元[12], 且能增加具備抗氧化性能的游離氨基酸含量, 如組氨酸、賴氨酸、纈氨酸和絲氨酸[13], 及酚類化合物的濃度[14]。

菌種及發酵工藝是影響發酵豆粕質量的關鍵因素, 不同菌種或發酵工藝對豆粕營養成分的改善作用不同[15]。楊慧等[16]研究表明, 枯草芽孢桿菌在固態發酵時降解豆粕抗原蛋白和降低豆粕抗原性的效果優于植物乳桿菌、干酪乳桿菌、地衣芽孢桿菌和米曲霉。而葉耀輝等[17]分別以芽孢菌類、酵母菌類和乳酸菌類對豆粕進行不同類型的發酵,結果表明, 接種芽孢類微生物的發酵豆粕小分子蛋白質含量最高, 發酵程度最好。本試驗所用的發酵豆粕是以枯草芽孢桿菌為菌種, 將豆粕在有氧條件下充分發酵后的產品, 對大分子蛋白的去除率高于常見的乳酸菌厭氧發酵豆粕, 且保留了大量有益的芽孢桿菌[18], 其營養組成及抗營養因子含量如表 1,氨基酸組成如表 2。關于枯草芽孢桿菌有氧發酵豆粕的研究目前主要集中在對豆類蛋白質水解及提高抗氧化活性方面[19,20], 對飼喂效果方面的研究較少, 僅見虹鱒(Oncorhynchus mykiss)[21]、巖魚(Sebastes schlegeli)[22]和日本尖吻鱸(Lateolabrax japonicus)[9]等幾個品種, 而在大口黑鱸中的研究甚少, 且對腸道菌群影響的研究鮮有報道。本文旨在探討枯草芽孢桿菌有氧發酵豆粕對大口黑鱸幼魚生長、脂質代謝、血清非特異性免疫及腸道菌群的影響, 以期為大口黑鱸配合飼料的研發優化和大口黑鱸人工養殖業的健康發展提供理論依據。

表1 豆粕和發酵豆粕營養組成及抗營養因子含量Tab. 1 Nutritional composition and anti-nutritional factor content of soybean meal and fermented soybean meal (%)

表2 豆粕和發酵豆粕氨基酸組成Tab. 2 Amino acid composition of soybean meal and fermented soybean meal (%)

1 材料與方法

1.1 試驗魚

試驗用魚購自于上海秦皇山漁業有限公司, 試驗正式開始之前進行1個月的馴養, 馴養期間投喂加州鱸魚1號料。

1.2 試驗飼料

以魚粉為主要蛋白源, 以魚油、豆油及大豆磷脂油為主要脂肪源配制基礎飼料。在基礎飼料中用發酵豆粕替代0、10%、20%、30%和40%魚粉,另外補充晶體蛋氨酸與賴氨酸使之達到與基礎組同等水平(相比于其他必需氨基酸, 蛋氨酸與賴氨酸是大口黑鱸的限制性氨基酸, 因此配方在滿足其營養需求的同時保證各組蛋氨酸與賴氨酸水平一致), 將粉碎后過60目篩的所有原料按照配方的比例混合均勻, 配制成5種等氮等能(CP47%, GE19 MJ/kg)的試驗飼料, 分別為FM、FSM10、FSM20、FSM30和FSM40。混合的原料經飼料機制成直徑2 mm的顆粒, 60℃烘至水分低于10%, 密封于-20℃冰箱保存備用。試驗飼料配方及營養組成如表 3。

表3 飼料組成及營養水平(%干飼料)Tab. 3 Composition and nutrient levels of diets (% dry diet)

1.3 試驗分組與管理

在試驗開始時, 先對大口黑鱸進行24h的饑餓處理, 然后挑選體格健壯、規格均勻的魚進行分組。5組, 每組3個重復, 隨機放置初始體重為(22.05±0.09) g的魚30尾于15個大小一致的網箱中。試驗養殖周期為58d, 采取表觀飽食方式進行投喂, 每日兩次(8: 00和17: 00)。定期檢測水質, 水溫在26—32℃, 氨氮低于0.5 mg/L, pH為7.5—8.5,不間斷充氣, 每隔兩天換一次水, 換水量在1/3左右。

1.4 樣品采集與指標測定

在養殖試驗結束后, 大口黑鱸禁食24h, 然后統計每組魚的存活數、攝食量并稱重, 用于計算生長指標。每網箱隨機取12尾魚, 其中6尾分別測體長,稱體重、肝臟重和內臟重, 用于計算形體指標。其中3尾魚于-80℃保存, 用于全魚組分分析。另外3尾魚, 尾靜脈采血1 mL, 取血清于-80℃保存, 用于免疫等指標分析; 取腸道, 用75%酒精擦拭腸道外壁, 用生理鹽水沖洗數次, 混合成一個樣本收集于滅菌的EP管中, -80℃保存, 用于腸道微生物的檢測。

飼料、全魚水分含量采用105℃烘箱干燥恒重法(GB/T 6435-2014)測定, 粗蛋白質、粗脂肪和粗灰分含量依次采用凱氏定氮法(GB/T 6432-2018)、索氏抽提法(GB/T 6433-2006)和550℃灼燒法(GB/T 6438-2007)測定。

血清脂質代謝及免疫指標均采用南京建成生物工程研究所生產的試劑盒進行測定。其中血清甘油三酯(TG)含量采用GPO-PAP酶法測定; 血清總膽固醇(T-CHO)含量采用COD-PAP法測定; 血清低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)和高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)含量均采用直接法測定; 血清總蛋白(TP)含量采用考馬斯亮藍法測定; 堿性磷酸酶(AKP)和酸性磷酸酶(ACP)活性均采用磷酸苯二鈉法測定; 超氧化物歧化酶(SOD)、溶菌酶(LZM)活性依次采用WST-1法、比濁法測定。

使用E.Z.N.A.?soil DNA kit(Omega 美國)從每組每個平行3尾魚腸道混樣中提取微生物群落總DNA。DNA的完整性由1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測, DNA濃度和純度由超微量分光光度計(Nano-Drop2000)測定。以338F(5′-ACTCCTACGGGAG GCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGT WTCTAAT-3′)為引物, 擴增16S rRNA基因的V3—V4區。擴增程序為: 95℃預變性3min, 27個循環(95℃變性30s, 55℃退火30s, 72℃延伸30s), 72℃延伸10min (PCR儀: ABI GeneAmp?9700型)。使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR產物, 再利用AxyPrep DNAGel Extraction Kit (Axygen Biosciences, 美國)純化,2%瓊脂糖凝膠電泳檢測, 并用Quantus? Fluorometer (Promega, 美國)進行檢測定量。使用NEXTFLEX Rapid DNA-Seq Kit進行建庫。利用Illumina公司的Miseq PE300平臺進行測序(上海美吉生物醫藥科技有限公司)。

1.5 數據處理及分析

生長數據處理:

增重率(Weight gain rate,WGR, %)=100%×(試驗魚終末體重-試驗魚初始體重)/試驗魚初始體重;

特定生長率(Specific growth rate,SGR, %/d)=100%×(ln試驗魚終末體重-ln試驗魚初始體重)/試驗天數;

成活率(Survival rate,SR, %)=100%×試驗終末魚尾數/試驗初始魚尾數;

飼料系數(Feed coefficient ratio,FCR)=攝食飼料質量/(試驗魚終末體重-試驗魚初始體重);

肥滿度(Condition factor,CF, g/cm3)=100×體重/體長3;

肝體比(Hepatosomatic index,HSI)=100×肝臟重/體重;

臟體比(Viscerosomatic index,VSI)=100×內臟團重/體重;

飼料干物質表觀消化率(Apparent digestibility of dry matter,ADDM, %)=100%×(1-飼料中三氧化二釔的含量/糞便中三氧化二釔的含量)。

Illumina Mi seq 測序數據處理:

使用Trimmomatic軟件原始測序序列進行質控,使用Flash軟件進行拼接。使用Uparse軟件, 根據97%的相似度對序列進行OTU聚類并剔除嵌合體。利用RDP Classifier對每條序列進行物種分類注釋, 比對Silva數據庫(SSU 128), 設置比對閾值為70%。對原始的OTU數據進行抽平處理。利用Mothur軟件對腸道菌群組成進行Alpha多樣性指數分析。使用R語言工具作Venn圖、群落柱狀圖。基于樣本中群落豐度數據, 做多物種差異檢驗柱形圖。

使用SPSS 25.0軟件對數據進行單因素方差分析,差異顯著則用Duncan氏法進行多重性比較, 結果以平均值±標準誤(mean±SE)表示, 顯著水平為P＜0.05。

2 結果

2.1 發酵豆粕替代魚粉對大口黑鱸幼魚生長的影響

由表 4可知, 各試驗組間WGR、SGR均無顯著差異(P＞0.05); FM、FSM10、FSM20和FSM30等4組的SR無顯著差異(P＞0.05), 但均顯著高于FSM40組(P＜0.05); FSM10、FSM20、FSM30和FSM40等4組的FCR均無顯著差異(P＞0.05), 但均顯著高于FM組(P＜0.05)。

表4 發酵豆粕替代魚粉對大口黑鱸幼魚生長指標的影響Tab. 4 Effects of replacing fish meal with fermented soybean meal on growth indices of juvenile largemouth bass (n=3)

由表 5可知, 各試驗組間CF、HSI和VSI均無顯著差異(P＞0.05); FSM40組ADDM顯著低于其余各組(P＜0.05), FSM10、FSM20和FSM30三組與FM組無顯著差異(P＞0.05)。

表5 發酵豆粕替代魚粉對大口黑鱸幼魚形體指標(n=18)及干物質表觀消化率(n=3)的影響Tab. 5 Effects of replacing fish meal with fermented soybean meal on body shape (n=18) and ADDM (n=3) of juvenile largemouth bass

2.2 發酵豆粕替代魚粉對大口黑鱸幼魚體成分的影響

由表 6可知, 各組間大口黑鱸的體成分中粗蛋白、粗脂肪和粗灰分差異不顯著(P＞0.05); 全魚的水分出現了差異, FSM10和FSM20組水分顯著低于FM組(P＜0.05)。

表6 發酵豆粕替代魚粉對大口黑鱸幼魚體成分的影響Tab. 6 Effects of replacing fish meal with fermented soybean meal on body composition of juvenile largemouth bass (%, n=3)

2.3 發酵豆粕替代魚粉對大口黑鱸幼魚脂質代謝的影響

由表 7可知, FSM40組血清TG含量和FSM30和FSM40組血清T-CHO含量顯著低于FM組(P＜0.05), 各組間LDL-C和HDL-C含量均無顯著差異(P＞0.05)。

表7 發酵豆粕替代魚粉對大口黑鱸幼魚脂質代謝的影響Tab. 7 Effects of replacing fish meal with fermented soybean meal on lipid metabolism of juvenile largemouth bass (mmol/L,n=9)

2.4 發酵豆粕替代魚粉對大口黑鱸幼魚血清非特異性免疫的影響

由表 8可知, 隨著發酵豆粕替代魚粉比例的增加, 大口黑鱸血清中TP含量、AKP和ACP活性均無顯著變化(P＞0.05), 但FSM40組血清中LZM和SOD活性均顯著高于FM、FSM10、FSM20和FSM30組(P＜0.05)。

表8 發酵豆粕替代魚粉對大口黑鱸幼魚血清非特異性免疫的影響Tab. 8 Effects of replacing fish meal with fermented soybean meal on serum nonspecific immunity of juvenile largemouth bass (n=9)

2.5 發酵豆粕替代魚粉對大口黑鱸幼魚腸道菌群多樣性和OTU數量的影響

根據各組樣本OTU數量, 采用Sobs指數、Shannon指數、Simpson指數、Ace指數和Chao指數對腸道菌群進行Alpha多樣性分析(表 9)。五組覆蓋度在99.86%—99.93%, 表示測序量充足, 可以反映大口黑鱸腸道菌群的真實情況。另外, 各組之間Sobs指數、Shannon指數、Simpson指數、Ace指數和Chao指數雖有差異, 但差異均不顯著(P＞0.05)。

表9 樣品的Alpha多樣性指數Tab. 9 Alpha-diversity of samples

進一步分析各組樣品中細菌多樣性的相互關系, 并構建Venn圖(圖 1)。由圖 1可知, 五組腸道樣品一共有647個OTUs, 其中32個共同OTUs, 占五組OTU總數的4.95%; FM組和FSM10組共有73個OTU, 占FM組OTU數的70.87%, 占FSM10組OTU數的28.52%; FM組和FSM20組共有73個OTU, 占FM組OTU數的70.87%, 占FSM20組OTU數的33.64%; FM組和FSM30組共有66個OTU, 占FM組OTU數的64.08%, 占FSM30組OTU數的16.84%;FM組和FSM40組共有65個OTU, 占FM組OTU數的63.11%, 占FSM40組OTU數的21.59%。

圖1 OTU數量對比維恩圖Fig. 1 Venn diagram representing shared OTUs

2.6 發酵豆粕替代魚粉對大口黑鱸幼魚腸道菌群組成的影響

如圖 2所示，從腸道中共檢測出軟壁菌門(Tenericutes)、變形菌門(Proteobacteria)、梭桿菌門(Fusobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)五個門及其他未被分類的細菌。其中, 梭桿菌門(63.87%)、變形菌門(22.18%)和軟壁菌門(13.53%)為FM組的優勢菌門。FSM10、FSM30和FSM40組的優勢門相同, 為變形菌門(71.98%、36.51%和62.38%)、軟壁菌門(18.84%、55.61%和34.63%)。而FSM20組的優勢門為軟壁菌門(83.09%)、梭桿菌門(11.82%), 變形菌門(3.97%)為劣勢門, 其相對豐度低于其余各組。

圖2 腸道菌群組成(門水平)Fig. 2 Composition of intestinal flora (phylum level)

如圖 3所示，從腸道中共檢測出支原菌屬(Mycoplama)、鄰單胞菌屬(Plesiomonas)、鯨桿菌屬(Cetobacterium)、氣單胞菌屬(Aeromonas)、羅姆布茨菌屬(Romboutsia)、紫單胞菌科中某一屬(Dysgonomonas)6個屬及其他未被分類的細菌。其中,鯨桿菌屬(63.87%)、鄰單胞菌屬(21.82%)和支原菌屬(13.53%)為FM組的優勢屬。FSM10、FSM30和FSM40組的優勢屬相同, 為鄰單胞菌屬(61.51%、34.51%和60.32%)和支原菌屬(18.83%、55.61%和34.63%)。而FSM20組的優勢屬為支原菌屬(83.09%)和鯨桿菌屬(11.82%), 鄰單胞菌屬(3.39%)為劣勢屬,其相對豐度低于其余各組。

圖3 腸道菌群組成(屬水平)Fig. 3 Composition of intestinal flora (genus level)

2.7 微生物群落差異分析

基于樣本中群落豐度數據, 進行組間差異顯著性檢驗。腸道菌群門水平上的單因素方差分析圖如圖 4所示, 各組間軟壁菌門、變形菌門差異顯著(P＜0.05)。腸道菌群屬水平上的單因素方差分析圖如圖 5所示, 各組間支原菌屬、鄰單胞菌屬同樣也具有顯著差異(P＜0.05)。

圖4 單因素方差分析條形圖(門水平)Fig. 4 One-way ANOVA bar plots (phylum level)

圖5 單因素方差分析條形圖(屬水平)Fig. 5 One-way ANOVA bar plots (genus level)

3 討論

3.1 發酵豆粕替代魚粉對大口黑鱸幼魚生長的影響

本研究結果表明, 發酵豆粕替代20%—30%的魚粉不會對大口黑鱸生長產生負面影響。已有的研究中也出現了類似結果。Choi等[23]研究發現, 發酵豆粕替代40%的魚粉, 不會對虹鱒的WGR產生影響。Luo等[24]發現發酵豆粕替代斜帶石斑魚(Epinephelus coioides)飼料中10%的魚粉, 魚的生長和魚體組成沒有顯著變化。He等[25]研究表明, 在保持限制性氨基酸水平一致的條件下, 發酵豆粕替代不超過30%的魚粉, 大口黑鱸的SGR、SR和CF與對照組相比均無顯著差異。在飼料中大豆蛋白產品的含量超過一定水平, 會導致生長性能受損和飼料利用效率低下, 這與幾個因素有關, 包括飼料中可消化碳水化合物水平的增加[26], 抗營養因子的存在和飼料適口性降低[4], 及氨基酸濃度不平衡[27]。在本研究中, 低于40%替代比例的組別其生長性能均未和FM對照組產生顯著差異, 這可能是因為發酵消除了豆粕中大量的抗營養因子, 降解了多數大分子蛋白, 從而提高了魚類對發酵豆粕的消化吸收能力[28]。另外, 也可能是因為在飼料中添加了適量的晶體氨基酸(賴氨酸和蛋氨酸)從而消除了限制性氨基酸的不良影響[29]。此外, 本研究結果還顯示, 隨著發酵豆粕替代比例的上升, 試驗魚HSI和VSI呈現逐漸降低的趨勢, 這表示在一定程度上發酵豆粕可以促進脂肪的吸收, 但效果并不顯著。這與He等[25]在大口黑鱸飼料中用發酵豆粕替代45%及以上比例的魚粉可以顯著降低試驗魚HSI的研究結果有所不同,可能是由于發酵豆粕和飼料配方不同所致。

魚類的消化率除了受到飼料中抗營養因子的影響還和其腸道消化酶活性有關。有研究表明, 用豆粕代替飼料中60%的魚粉顯著降低了烏鱧(Channa argus)的腸道消化酶活性[30], 發酵可以通過降解飼料中的大分子蛋白及提高石斑魚(Epinephelus coioides)的腸道消化酶活性來提高營養物質的消化率[31]。在本研究中, 發酵豆粕中胰蛋白酶抑制因子、水蘇糖和棉籽糖含量大大降低, 因此即使替代水平達到30%時, 試驗魚的ADDM也并未和對照組產生顯著差異。而FSM40組ADDM的顯著下降則可能和魚類腸道消化酶活性降低有關, 有待進一步研究。

3.2 發酵豆粕替代魚粉對大口黑鱸幼魚體成分的影響

植物蛋白替代魚粉對魚體成分的影響與魚的種類、大小和替代水平等因素相關。據報道, 植物蛋白替代魚粉不會對虹鱒[21]、佛羅里達鯧鲹(Trachinotus carolinus)[32]、巖魚[22]等的體組成造成顯著影響, 但也有研究認為高水平(80%和75%)替代會顯著增加石斑魚(Epinephelus lanceolatus)[33]和日本尖吻鱸[34]的水分, 降低其粗蛋白和粗脂肪含量。本研究結果表明, 低水平替代組(10%和20%)與對照組相比顯著降低了水分含量, 而粗蛋白和粗脂肪含量卻有升高。而Daniela等[35]用豆制品替代魚粉飼養鋸蓋魚(Centropomus viridis)的研究中也得到了類似的結果。

3.3 發酵豆粕替代魚粉對大口黑鱸幼魚脂質代謝的影響

血清TG和T-CHO是魚類肝臟脂質代謝的重要指標[36], 而且兩者在動物機體的變化趨勢也基本一致。在本研究中, 隨著發酵豆粕替代比例的增加,血清TG和T-CHO含量先增后減, FSM40組的TG含量顯著低于FM對照組, FSM30和FSM40組的TCHO含量顯著低于FM對照組。這種情況說明適量的發酵豆粕替代魚粉后可以改善大口黑鱸肝臟脂質代謝狀況, 而LDL-C水平的變化趨勢也與之相互印證。另外高水平替代組血清TG和T-CHO含量的減少可能是大豆中的異黃酮[37]或者植物固醇[38]起的作用, 至于脂質代謝的其他分子機制還待進一步研究。

3.4 發酵豆粕替代魚粉對大口黑鱸幼魚血清非特異性免疫的影響

血清TP含量是衡量機體蛋白質和氨基酸的利用率的重要指標之一[39]。在本研究中, 隨著發酵豆粕替代魚粉水平的增加, 血清TP水平逐漸升高但并無顯著變化。這表明在飼料中添加發酵豆粕在一定程度上可以促進血清蛋白質的合成, 從而提高機體免疫力。非特異性免疫系統作為防御系統的第一道防線, 對魚類的抗病性尤為重要[40]。而LZM是其重要組成部分, 可以通過裂解細菌細胞壁而殺滅細菌[41]。在本研究中, 血清LZM活性隨著發酵豆粕替代魚粉比例的增加而逐漸上升并且在替代比例達到40%時與對照組產生顯著差異, 這說明在本試驗條件下發酵豆粕可以增強大口黑鱸的非特異性免疫力。益生菌在宿主胃腸道中既能作為免疫興奮劑、改變酶活又能調節微生物群落結構, 有益于宿主健康[42]。推測原因可能是發酵豆粕中益生菌芽孢桿菌起到的免疫刺激作用。類似的結果, 在羅非魚(Oreochromis niloticus)[43]、卵形鯧鲹(Trachinotus ovatus)[44]、異育銀鯽(Carassius auratus gibeliovar.CAS Ⅲ)[45]中均有發現。SOD是抗氧化酶防御系統的第一道防線[46]。Zhang等[45]用發酵辣木葉替代魚粉飼喂異育銀鯽, 結果表明替代組血清SOD活性均顯著升高。Choi等[23]用枯草芽孢桿菌、乳酸菌和酵母菌混合發酵的豆粕替代魚粉, 研究發現虹鱒血清SOD活性隨著發酵豆粕替代水平上升而上升。本研究結果顯示, 發酵豆粕替代魚粉可提高血清SOD活性, 替代水平為40%時與對照組產生顯著差異。芽孢桿菌可以刺激抗氧化酶和抗氧化劑的產生, 從而起到清除機體自由基、維持穩態、提高抗氧化能力的作用[46,47]。推測本研究結果可能和發酵豆粕中的枯草芽孢桿菌有關, 也可能和發酵豆粕中某些具有提高機體抗氧化能力的游離氨基酸有關[13]。

3.5 發酵豆粕替代魚粉對大口黑鱸幼魚腸道菌群多樣性及組成的影響

魚類腸道內的菌群種類豐富、數量龐大[48]。穩定且有益的腸道菌群對宿主的生長、健康起重要作用[49]。一旦腸道菌群失調, 宿主的免疫系統就有可能受到影響, 條件性致病菌還可能轉移或危害宿主的其他組織器官, 導致細菌性疾病的爆發[50]。近幾年, 研究人員廣泛報道了富含營養物質(包括益生元、益生菌、小肽、游離氨基酸)的發酵豆粕是如何改善魚類腸道微生物的[51,52]。和Wang等[52]研究結果類似, 在本研究中, 發酵豆粕替代魚粉并未顯著改變大口黑鱸腸道菌群的多樣性。這樣看來腸道菌群的多樣性并非是決定魚類生長性能的關鍵因素。而魚類腸道菌群組成, 在門的分類水平上, 軟壁菌門、變形菌門和梭桿菌門占絕對優勢,在屬的分類水平上, 支原菌屬、鄰單胞菌屬和鯨桿菌屬占絕對優勢, 推測這些菌群可能是在魚類苗種時期定值下來的[53], 大口黑鱸腸道存在一個以支原菌屬、鄰單胞菌屬和鯨桿菌屬為主的本土微生物群落。這與Larsen等[54]在大口黑鱸上的研究結果類似。而門和屬水平上細菌相對豐度的差異可能與養殖環境、魚類大小和飼料營養組成有關。

在通常情況下, 條件性致病菌是動物腸道菌群的正常組成部分, 只有在某些特定情況下, 才會引起疾病[50]。支原體隸屬支原體科、柔膜菌綱, 是一類廣泛存在于人和動物體內, 呈革蘭氏陰性的原核細胞型微生物[55]。支原體屬中的某些物種還是哺乳動物腸道中的潛在致病菌[56], 但已有研究證實支原體是魚類腸道中正常菌群的一部分, 且其在健康和生理上可能發揮著某種未知的作用[57]。支原體的生長及繁殖需要葡萄糖和果糖, 而豆粕發酵會產生葡萄糖和果糖[58], 所以本研究替代組魚類腸道中支原體屬相對豐度均高于對照組。鄰單胞菌屬是養殖水體和淡水魚體中常見的細菌, 其中的志賀氏鄰單胞菌(Plesiomonas shigelloides)則不僅是人類腸道疾病的病原菌[59], 同時也是草魚(Ctenopharyngodon idellus)[60]、銀鯉(Hypophthalmichthys molitrix)[61]和羅非魚[62]等魚類的致病菌。有研究表明,高水平發酵豆粕替代組受某些抗營養因子(如大豆球蛋白等)的影響, 會打破腸道菌群的穩態, 阻礙益生菌的生長, 使得變形菌門物種豐度增加[63]。而本研究, 飼料中大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白并未被降解完全, 因此組間變形菌門及該門內鄰單胞菌屬的相對豐度的變化(20%替代組顯著低于40%替代組)可能是由于飼料中殘留的大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白引起的。這與何嬌嬌等[64]在大黃魚上的研究結果類似, 與高水平(75%)發酵豆粕替代組相比, 中水平(45%)添加組幼魚腸道內水棲菌屬(Enhyd-robacter)和對照組副球菌屬(Paracoccus)物種豐度均顯著降低。

4 結論

發酵豆粕與豆粕相比, 抗營養因子含量顯著降低, 氨基酸含量有所提升, 其替代魚粉水平較低時不會對大口黑鱸幼魚的生長、脂質代謝、血清非特異性免疫及腸道菌群產生負面影響, 且在一定程度上可以促進魚類對脂肪的吸收, 降低肝體比和臟體比。而替代水平過高則會顯著降低試驗魚成活率、干物質表觀消化率、血清甘油三酯和總膽固醇含量, 引起魚類免疫應激, 腸道菌群失衡。因此綜合各方面的結果, 在此試驗條件下, 魚粉含量為54.95%的飼料中發酵豆粕替代魚粉的適宜比例為20%。