玉屏風(fēng)多糖合生元對熱應(yīng)激草魚免疫性能的影響

劉 華 鄧桃球 史銀魁 于 輝 楊 映 施益如 蔡明燴 段玉婉

(1. 佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院廣東省動物分子設(shè)計與精準(zhǔn)育種重點實驗室, 佛山 528225;2. 佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院, 佛山 528225)

草魚(Ctenopharyngodon idella)是我國淡水養(yǎng)殖產(chǎn)量最大的經(jīng)濟魚類, 具有肉嫩、少刺、營養(yǎng)豐富和口感鮮美等特點。胡宗福等[1]研究表明魚肉中必需氨基酸含量高、種類豐富。黃春紅等[2]研究表明草魚粗蛋白質(zhì)和粗脂肪含量高, 口感鮮美。然而,魚類的體溫的調(diào)控主要依賴水體溫度, 水溫的變化可對硬骨魚的生長和免疫性能產(chǎn)生影響[3,4]。宋文華等[5]研究發(fā)現(xiàn)在高溫環(huán)境下, 草魚免疫力下降, 從而導(dǎo)致各類疾病發(fā)生。水溫的急劇變化或者超過魚類適宜溫度范圍都會導(dǎo)致魚類免疫功能的紊亂,使機體無法正常執(zhí)行免疫功能, 從而增加魚類對病原體的易感性[6,7]。因此, 提高在高溫環(huán)境下水產(chǎn)動物免疫性能的研究應(yīng)用引起高度重視。

玉屏風(fēng)散是由白術(shù)、黃芪和防風(fēng)三味中草藥組成的一種復(fù)合中草藥, 陳向濤[8]通過活性篩得到玉屏風(fēng)散最具藥理活性的多糖類成分就是玉屏風(fēng)多糖(Yu-Ping-Feng Polysaccharide), 具有增強水產(chǎn)動物免疫力, 改善腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)以及促進生長發(fā)育等作用[9,10]。益生菌(Probiotics)是指促進其他生物健康的微生物, 如嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)、嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)和枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)等。嗜酸乳桿菌和枯草芽孢桿菌在魚類腸道酸性環(huán)境中比較穩(wěn)定, 既提高機體免疫力又促進魚類體內(nèi)的糖代謝水平[11],而嗜熱鏈球菌具有生產(chǎn)胞外多糖(Exopolysaccharide, EPS)的生理特性, 已有文獻報道EPS具有抗氧化[12]和免疫調(diào)節(jié)作用[13]。合生元(Synbiotics)又稱合生素, 是使用益生菌和益生素配伍組成的新型微生態(tài)制劑[14], 而玉屏風(fēng)多糖合生元則是益生菌與玉屏風(fēng)多糖的結(jié)合, 兩者配合能提高玉屏風(fēng)多糖的活性成分和生物學(xué)效價, 充分發(fā)揮出兩者間的協(xié)同效應(yīng)。我們前期的研究表明玉屏風(fēng)多糖和益生菌結(jié)合使用對比單獨使用復(fù)合益生菌更能提高烏鱧(Channa argus)的抗氧化能力和免疫能力[9]。因此,本研究通過制備玉屏風(fēng)多糖合生元, 改進中藥多糖添加劑效果, 研究其對高溫條件下草魚免疫功能的影響, 為其在生產(chǎn)中的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

草魚購自南海百容水產(chǎn)良種有限公司, 無注射疫苗和使用抗生素記錄, 平均體重為(20±2) g。復(fù)合益生菌由嗜酸乳桿菌、嗜熱鏈球菌和枯草芽孢桿菌按體積為1∶1∶1比例混合后測得嗜酸乳桿菌活菌量為1.0×109cfu/mL, 嗜熱鏈球菌活菌量為1.0×109cfu/mL, 枯草芽孢桿菌活菌量為1.2×109cfu/mL, 菌種均由中國普通微生物菌種保藏管理中心提供。玉屏風(fēng)多糖由佛山德眾藥業(yè)有限公司提供。實驗飼料配方見表 1。

表1 飼料配方及生化組成(%干物質(zhì))Tab. 1 Feed formulation and biochemical composition (% dry matter)

1.2 試驗設(shè)計與飼養(yǎng)管理

選平均體重(20±2) g 的健康草魚360尾, 隨機分為4組, 即對照組(Ⅰ組)和試驗組(Ⅱ—Ⅳ組), Ⅰ組飼喂基礎(chǔ)飼料, Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ組在基礎(chǔ)飼料中分別添加0.08%、0.12%和0.20%玉屏風(fēng)多糖, 并在飼喂前按復(fù)合益生菌體積(mL)/飼料重(g)為 1%的劑量添加復(fù)合益生菌(由乳酸菌、嗜熱鏈球菌、枯草芽孢桿菌按體積1∶1∶1比例混合而得)拌料。每組3個重復(fù), 每個重復(fù)30 尾。預(yù)試期10d, 試驗期為21d, 每天保持24h充氣增氧, 控制水溫在26—28℃, 每天飼喂2次(8:00和17:00), 日投飼量為魚群總重量的2%—4%, 每次根據(jù)攝食情況進行飼喂。

1.3 試驗樣品的采集與測定方法

試驗樣品的采集在飼養(yǎng)試驗結(jié)束后, 從各組隨機選擇體重基本一致的健康草魚在充足的溶氧條件下, 對其進行熱應(yīng)激(32—34℃)48h。在熱應(yīng)激0、6h、24h和48h的4個時間點從各組隨機抽取3尾草魚進行心臟采血, 3000 r/min冷凍離心5min,移取上層血清于1.5 mL EP管中, 編號并置于-80℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆?。在魚體采血后立即解剖并剝離其肝臟, 編號并置于-80℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

血清、肝臟生化指標(biāo)的測定血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)和肝胰臟樣品中總超氧化物歧化酶(SOD)、總抗氧化能力(TAOC)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、谷胱甘肽還原酶(GR)和丙二醛(MDA)含量的測定均按照試劑盒說明書進行。所有試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

草魚肝臟相關(guān)基因表達量的測定分別用試劑盒提取總 RNA 與cDNA反轉(zhuǎn)錄, 試劑盒均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

以草魚β-actin為管家基因, 并參考文獻[15,16]及NCBI上公布的草魚Nrf2、Keap1、Cu-Zn SOD、GSH-Px、HSP70、GR、MHCII和IL-8基因設(shè)計相應(yīng)的引物序列(表 2), 并由上海生工公司合成。對所合成的引物進行PCR擴增后, 使用1%凝膠電泳檢測樣品DNA質(zhì)量, 并將PCR產(chǎn)物交由上海生物工程有限公司進行測序。

表2 目的基因引物序列Tab. 2 Target gene primer sequence

使用PerfectStartTMGreen qPCR SuperMix試劑盒(北京全式金生物技術(shù)有限公司)進行定量反應(yīng),反應(yīng)體系20 μL: 2×PerfectStartTMGreen qPCR Super-Mix 10 μL, Passive Reference Dye (50×) 0.4 μL, Forward Primer (10 μmol/L) 0.4 μL, Nuclease-free Water 7.8 μL, Reverse Primer (10 μmol/L) 0.4 μL, cDNA模板 1 μL。反應(yīng)程序為: 94℃ 預(yù)變性30s; 94℃ 5s,60℃ 30s, 72℃ 30s, 40個循環(huán)。目的基因相對表達量采用 2-ΔΔCt方法計算。

1.4 數(shù)據(jù)分析

統(tǒng)計學(xué)分析利用SPSS19.0進行單因素方差分析(One-way ANOVA), 利用DUNCAN氏進行多重比較分析,P＜0.05為差異性標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 熱應(yīng)激下不同水平玉屏風(fēng)多糖合生元對草魚血清生化指標(biāo)的影響

由圖 1可知, 各組ALT活力隨時間的延長呈先升高后降低趨勢, 在應(yīng)激后24h時達到最大值, 各組AST活力隨時間點的延長呈上升趨勢且各時間點間差異顯著(P＜0.05), 而各添加YPF-P組ALT和AST活力在應(yīng)激前后均低于對照組。在應(yīng)激前,0.12%和0.20%YPF-P組的ALT活力顯著低于對照組(P＜0.05), 0.12%YPF-P組AST活力顯著低于對照組(P＜0.05)。在應(yīng)激后, 各添加YPF-P組ALT 活力在應(yīng)激6h時均顯著低于對照組(P＜0.05), 而0.12%YPF-P組在應(yīng)激后各時間點均顯著低于對照組(P＜0.05)。各添加YPF-P組AST活力在應(yīng)激后各時間點均顯著低于對照組 (P＜0.05), 而0.12%YPF-P組在應(yīng)激48h時顯著低于其他3組 (P＜0.05)。

圖1 熱應(yīng)激下玉屏風(fēng)多糖合生元對草魚血清生化指標(biāo)的影響Fig. 1 Effect of Yu-Ping-Feng Polysaccharide synbiotics on serum biochemical indexes of grass carp under heat stress

2.2 熱應(yīng)激下不同水平玉屏風(fēng)多糖合生元對草魚肝臟生化指標(biāo)的影響

由圖 2可知, 各組SOD、T-AOC、GSH-Px活力在應(yīng)激后有先升高后降低趨勢, 在應(yīng)激后6h時達到最大值。0.12%和0.20%YPF-P組SOD活力在應(yīng)激前后均高于對照組, 而0.12%YPF-P組SOD活力在應(yīng)激前和應(yīng)激24h時顯著高于對照組(P＜0.05)。各添加YPF-P組的T-AOC活力在應(yīng)激前后均高于對照組, 但無顯著性差異(P＞0.05)。各添加YPF-P組的GSH-Px活力和GR活力在應(yīng)激前后均高于對照組, 而0.12%和0.20%YPF-P組GSH-Px活力在應(yīng)激6h時顯著高于對照組(P＜0.05), 0.12%YPF-P組GR活力在應(yīng)激前和應(yīng)激48h時顯著高于對照組(P＜0.05)。各組MDA 含量在應(yīng)激后呈現(xiàn)上升的趨勢, 在應(yīng)激48h時MDA含量顯著高于應(yīng)激前(P＜0.05); 各添加YPF-P組MDA含量在應(yīng)激前后均低于對照組, 而0.12% YPF-P組MDA含量在應(yīng)激24h和48h時顯著低于對照組(P＜0.05)。

圖2 熱應(yīng)激下玉屏風(fēng)多糖合生元對草魚肝臟生化指標(biāo)的影響Fig. 2 Effects of Yu-Ping-Feng Polysaccharide synbiotics on liver biochemical indexes of grass carp under heat stress

2.3 熱應(yīng)激下不同水平玉屏風(fēng)多糖合生元對草魚肝臟相關(guān)基因表達的影響

由圖 3可知, 各組Nrf2相對表達在應(yīng)激24h和48h時顯著高于對照(P＜0.05), 而0.12%和0.20%YPF-P組在應(yīng)激0和6h時Nrf2相對表達量顯著高于對照組(P＜0.05)。除0.12%YPF-P組外其他3組Keap1相對表達在應(yīng)激24h時顯著高于應(yīng)激前(P＜0.05), 而0.12%和0.20%YPF-P組在應(yīng)激0、24h和48h時均顯著低于對照組(P＜0.05)。各組Cu/Zn-SOD相對表達量在應(yīng)激48h時顯著低于應(yīng)激前(P＜0.05), 而0.12%和0.20%YPF-P組在應(yīng)激0h和6h時顯著高于對照組(P＜0.05)。各組GSH-Px相對表達量在應(yīng)激后3個時間點與應(yīng)激前均無顯著性差異(P＞0.05), 而0.12%YPF-P組在應(yīng)激6h和24h時顯著高于對照組(P＜0.05)。各組GR相對表達量在應(yīng)激48h時顯著低于應(yīng)激前(P＜0.05), 而0.12%和0.20%YPF-P組在應(yīng)激0h、6h和24h時均顯著高于對照組(P＜0.05)。各組HSP70相對表達量在應(yīng)激24h和48h時顯著高于應(yīng)激前(P＜0.05), 且0.12%YPF-P組在應(yīng)激24h和48h時顯著高于對照組(P＜0.05)。各組IL-8相對表達量在應(yīng)激48h時顯著高于應(yīng)激前(P＜0.05), 而0.08%和0.12%YPF-P組在應(yīng)激24h和48h時均稍低于對照組, 但差異不顯著(P＞0.05)。各組MHCⅡ相對表達量在應(yīng)激48h時顯著低于應(yīng)激前(P＜0.05), 而添加YPF-P組在應(yīng)激前后均顯著高于對照組(P＜0.05)。

圖3 熱應(yīng)激下玉屏風(fēng)多糖合生元對草魚肝臟相關(guān)基因表達的影響Fig. 3 Effect of Yu-Ping-Feng Polysaccharide synbiotics on liver related gene expression of grass carp under heat stress

3 討論

3.1 玉屏風(fēng)多糖合生元對熱應(yīng)激條件下草魚血清免疫酶活力的影響

我們前期的研究表明玉屏風(fēng)多糖可以提高水產(chǎn)動物體內(nèi)抗氧化酶活力, 能夠消除機體多余的自由基并抑制脂質(zhì)過氧化[10,17,18]。而玉屏風(fēng)多糖合生元有助于益生菌在腸道內(nèi)的生長、繁殖和定植,從而改善機體腸道菌群平衡和提高其免疫力, 使用效果更佳[19]。ALT和AST為肝臟內(nèi)兩種轉(zhuǎn)氨酶, 是判斷肝細胞是否損傷的經(jīng)典性指標(biāo), 其活性變化同時也可以反映魚體的健康狀況[20]。在本研究中, 熱應(yīng)激后草魚血清ALT和AST活力在應(yīng)激后呈升高趨勢, 可能是由于魚體肝臟細胞膜被破壞, 導(dǎo)致ALT和AST釋放進入血液循環(huán)系統(tǒng), 進而引起血清中這兩種酶活性升高, 與Jeney等[21]報道的鯉受到環(huán)境脅迫后血清轉(zhuǎn)氨酶活力變化呈上升趨勢研究結(jié)果一致。邵彥翔等[22]、明建華等[15]和王晶晶等[23]的研究結(jié)果也都表明, 熱應(yīng)激會導(dǎo)致水產(chǎn)動物血清中ALT和AST活性升高。本研究結(jié)果表明, 試驗組在應(yīng)激前后均能夠不同程度降低草魚血清中ALT和AST活力, 而Ⅲ組ALT和AST活力熱應(yīng)激前后均顯著降低, 這表明該濃度玉屏風(fēng)多糖合生元具有較好的添加效果, 能減少熱應(yīng)激后草魚肝細胞氧化損傷。

3.2 玉屏風(fēng)多糖合生元對熱應(yīng)激條件下草魚肝臟抗氧化功能的影響

熱應(yīng)激會使魚體內(nèi)自由基增多, 誘發(fā)氧化損傷[24]。魚類肝臟中SOD、GSH-Px和GR等重要的抗氧化酶可以保護機體免受氧化損傷[25]。而MDA是機體產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)后產(chǎn)生的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物之一,熱應(yīng)激后其含量會增加。這表明熱應(yīng)激會使魚類產(chǎn)生大量氧化活性物, 導(dǎo)致魚體發(fā)生劇烈的氧化應(yīng)激反應(yīng)。劉波等[26]研究發(fā)現(xiàn), 在熱應(yīng)激后羅氏沼蝦肝胰腺T-AOC、SOD、GSH-Px等抗氧化酶活力降低, 而MDA含量增加; 類似的結(jié)果在金魚的研究中也有報道[27,28]。本研究發(fā)現(xiàn)草魚肝臟中SOD、T-AOC、GSH-Px 和GR活力隨著熱應(yīng)激時間的延長而呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢, 這可能是由于熱應(yīng)激時間過長導(dǎo)致產(chǎn)生的自由基數(shù)目過多, 嚴重超出魚體本身的清除能力, 從而使草魚的抗氧化功能受損。與對照組相比, 試驗組的草魚在熱應(yīng)激后肝臟中SOD、T-AOC、GSH-Px 和GR活力均有不同程度的提高, MDA呈降低趨勢, 而Ⅲ組的抗氧化酶活力和MDA含量熱應(yīng)激前后有不同程度地高于或低于其他3組, 表明在飼料中添加適量的玉屏風(fēng)多糖合生元可以提高魚體抗氧化酶的活性, 緩解熱應(yīng)激后草魚肝臟的氧化損傷。

3.3 玉屏風(fēng)多糖合生元對熱應(yīng)激條件下草魚肝臟基因表達的影響

Nrf2/ARE信號通路在激活后能夠啟動Ⅱ相解毒酶基因、下游抗氧化酶類基因和分子伴侶類基因等的表達[29]。Nrf2是Nrf2/ARE信號通路的轉(zhuǎn)錄因子[30],Keap1是Nrf2的抑制因子,Nrf2的表達上調(diào)可以提高建鯉肌肉中SOD1和GSH-PxmRNA的表達[22]。Nrf2/ARE信號通路抑制IL-8表達水平[31]。IL-8是一種促炎因子, 能夠趨化和激活中性粒細胞,釋放超氧化物和溶酶體酶, 促進中性粒細胞表面黏附分子的表達[32]。由試驗結(jié)果可知, 草魚在熱應(yīng)激48h后, 各組肝臟Nrf2、HSP70和IL-8的表達水平均顯著高于應(yīng)激前, 而抗氧化酶類基因(Cu/Zn-SOD、GSH-Px和GR)mRNA的表達水平均低于應(yīng)激前, 而抗氧化酶類基因與其相應(yīng)的抗氧化酶活性變化趨勢相似, 這表明可能熱應(yīng)激會導(dǎo)致魚體的炎癥反應(yīng),從而增強Nrf2和HSP70的表達水平提高魚體的抗氧化應(yīng)激能力, 但Nrf2持續(xù)積累可能對抗氧化酶類基因的表達有一定的抑制作用, 這與之前的研究類似[33]。MHCⅡ能結(jié)合并呈遞抗原給T淋巴細胞, 從而激發(fā)機體免疫反應(yīng)[34]。在熱應(yīng)激6h后各組MHCⅡ均呈下降趨勢, 這可能是由于持續(xù)的熱應(yīng)激使魚體肝臟組織受損導(dǎo)致免疫功能下降。在本研究中, 與對照組相比, 添加YPF-P組均能不同程度地提高Nrf2、HSP70、MHCⅡ和抗氧化酶類基因的表達水平,降低Keap1和IL-8的表達水平。而Ⅲ組在應(yīng)激前后這些基因分別達到較高或較低水平, 這可能是由于添加玉屏風(fēng)多糖合生元能增強魚體的抗氧化應(yīng)激能力, 從而減少熱應(yīng)激后的肝臟組織損傷。以上結(jié)果表明在飼料中添加適量的玉屏風(fēng)多糖合生元促進MHCⅡ的表達, 并能通過Nrf2/ARE信號通路促進草魚肝臟抗氧化酶類基因和分子伴侶類基因的表達而抑制IL-8的表達。

4 結(jié)論

綜合實驗結(jié)果可知, 隨著熱應(yīng)激時間的延長導(dǎo)致草魚的血清和肝臟生化指標(biāo)、相關(guān)基因表達量均產(chǎn)生了不同程度的變化, 說明熱應(yīng)激后草魚產(chǎn)生了強烈的應(yīng)激反應(yīng)。而玉屏風(fēng)多糖合生元對魚體起到一定的保護作用, 有助于提高草魚的抗氧化應(yīng)激能力, 有效緩解肝臟氧化損傷, 具有較好的免疫調(diào)節(jié)作用。在本實驗添加水平范圍內(nèi), 飼料中添加0.12%的玉屏風(fēng)多糖合生元的效果最好。