正交實(shí)驗優(yōu)選烏梅-木瓜飲提取工藝研究*

劉 奧，吳 薇，莊家蝶，陳夢蝶，張玉潔，王 成，李艷玲，左亞鋒

(亳州學(xué)院，安徽 亳州 236800)

酒文化在中國源遠(yuǎn)流長，故酒作為情感載體在人們生活和社交中占據(jù)重要地位，適量飲酒對促進(jìn)睡眠、消除疲勞有一定作用，但是人們往往忽略長期、過量飲酒導(dǎo)致酒精性肝病(ALD)的潛在危害[1]。研究表明我國部分地區(qū)的ALD患病率為0.50%～8.55%，其中年齡在40～49歲人群的ALD患病率達(dá)到11.6%[2]。酒精已成為我國繼病毒性肝炎后導(dǎo)致肝損傷的第二大病因，嚴(yán)重威脅我國人民生命健康[3]。ALD的發(fā)病風(fēng)險與飲酒的量及時間密切相關(guān)，故飲酒后需要及時解酒，預(yù)防由酒精引起的肝臟損傷和可能導(dǎo)致的酒精性脂肪肝、肝硬化，甚至肝癌[4-6]。

烏梅-木瓜飲原方來源于《飲膳正要》梅子丸，由烏梅、木瓜、炙甘草、紫蘇葉、檀香等組成，具有生津止渴，解化酒毒，祛濕的功效[7]。烏梅-木瓜飲在原方的基礎(chǔ)上進(jìn)行刪減，去除麝香和檀香，保留烏梅、木瓜、炙甘草、紫蘇葉等藥食同源品種[8]，現(xiàn)代藥理研究表明組方中烏梅、木瓜、炙甘草、紫蘇葉等具有一系列生物活性，對酒精引起的肝臟損傷又一定的保護(hù)作用[9-15]。本研究對烏梅-木瓜飲提取工藝進(jìn)行研究，旨在優(yōu)選穩(wěn)定可行的提取工藝，為烏梅解酒飲料的研發(fā)提供研究基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

SPD-16島津高效液相色譜儀，島津制作所日本京都；Genie U超純水機(jī)，上海樂楓生物科技有限公司；JK-300B型數(shù)控超聲波清洗器，鄭州南北儀器設(shè)備有限公司；SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式多用真空泵，上海子期實(shí)驗設(shè)備有限公司；FA2104N型分析天平，上海菁海儀器有限公司；XS105型電子天平，梅特勒-托利多儀器上海有限公司；DFY-400型打粉機(jī)，溫嶺市大機(jī)械有限公司。

齊墩果酸對照品，江蘇永健醫(yī)藥科技有限公司；枸櫞酸對照品，江蘇永健醫(yī)藥科技有限公司；乙腈(色譜純)，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；甲醇(色譜純)，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；磷酸(分析純)，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；烏梅、干木瓜、炙甘草、紫蘇葉均購自安徽協(xié)和成藥業(yè)飲片有限公司，白梅自制[16]，由孟祥松教授鑒定，均符合2020版《中國藥典》規(guī)定。

2 方法與結(jié)果

2.1 正交實(shí)驗

據(jù)預(yù)試情況，采用加熱回流的提取方法，以加熱回流時間(A)、液料比(B)、乙醇濃度(C)為考察因素，以干膏率和枸櫞酸、齊墩果酸含量為評價指標(biāo)，進(jìn)行L9(34)正交實(shí)驗，(注：出膏率和枸櫞酸、齊墩果酸提取率的權(quán)重系數(shù)分別為0.4、0.4、0.2，出膏率最大定為100分，枸櫞酸含量以最大定為100分，齊墩果酸含量最大定為100分，進(jìn)行綜合評分。綜合得分=出膏率得分×40%+枸櫞酸得分×40%+齊墩果酸得分×20%)。因素水平表見表1，正交實(shí)驗設(shè)計及結(jié)果見表2，方差分析見表3。從表 2 結(jié)果和極值 R 可以看出，三個因素的影響大小依次為 C>B>A，即乙醇濃度>料液比>回流時間，A1>A2>A3，B1>B2>B3，C3>C1>C2，最佳提取工藝為 A1B1C3。表3的方差分析表明，乙醇濃度、料液比、回流時間對試驗結(jié)果差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。綜合直觀分析與方差分析，得到最優(yōu)提取工藝為 A1B1C3。由直觀分析結(jié)果可知，A1B1C3為最佳提取工藝，即提取0.5 h，加5倍量乙醇溶液，乙醇濃度90%。

表1 因素水平表

表2 正交實(shí)驗設(shè)計及結(jié)果

表3 方差分析表

2.2 出膏率測定方法

按處方量分別稱取各味藥材共9份，按正交實(shí)驗設(shè)計方案進(jìn)行提取，提取后的濾液定容后置水浴鍋上濃縮，于恒重的蒸發(fā)皿中水浴干燥，再放入真空干燥箱烘干至恒重，稱量。按公式：出膏率=出膏量/藥材總重量×100%，計算出膏率。

2.3 枸櫞酸和齊墩果酸含量測定

2.3.1 色譜條件

色譜柱XSelect? C8HTMC18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；檢測波長：210 nm，柱溫：40 ℃，以乙腈為流動相A，0.05%磷酸水溶液為流動相B，(梯度洗脫程序如下：0～10 min，2%A；10～15 min，84%A；15～36 min，84%A；36～42 min，2%A)，進(jìn)樣量10 μL，流速1.0 mL/min[17-20],見圖1。

圖1 對照品和供試品的色譜圖Fig.1 Chromatogram of reference substance and test substance

2.3.2 溶液的制備

2.3.2.1 對照品溶液的制備

精密稱定枸櫞酸50.35 mg，置10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋，制成每1 mL含5.035 mg枸櫞酸的對照品溶液。精密稱定齊墩果酸9.00 mg定容于50 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度線處然后稀釋，制成每1 mL含0.01636 mg齊墩果酸的對照品溶液。

2.3.2.2 供試品溶液的制備

取1～9號干膏樣品1.0 g，用甲醇定容至10 mL容量瓶中備用，用0.45 μm有機(jī)系濾頭濾過，即得1～9號供試品。

2.3.3 方法學(xué)考察

2.3.3.1 線性關(guān)系考察

分別精密移取枸櫞酸對照品溶液0.1 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL、0.7 mL，置于1 mL的容量瓶中，用甲醇稀釋定容至刻度；精密移取齊墩果酸對照品溶液0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL置于1 mL的容量瓶中，用甲醇稀釋定容至刻度。按“2.1.1”色譜條件下測定，以對照品濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，得對照品溶液的線性回歸方程。枸櫞酸回歸方程Y=372694X+609272(r=0.9994)，表明枸櫞酸在0.05035～0.3524 mg/mL范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系；齊墩果酸回歸方程Y=5500.3X+11845(r=0.9995)，表明齊墩果酸在0.001636～0.009816 mg/mL范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

2.3.3.2 精密度實(shí)驗

精密吸取對照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，測定峰面積。結(jié)果得枸櫞酸峰面積的RSD值為0.16%、齊墩果酸峰面積的RSD值為0.30%，表明本方法精密度良好。

2.3.3.3 穩(wěn)定性實(shí)驗

取同一供試品溶液適量，分別于 0、2、4、6、8、24 h 進(jìn)樣測定。結(jié)果得枸櫞酸峰面積的RSD值為2.62%，齊墩果酸峰面積的RSD值為0.56%，表明本方法所制備得的供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.3.4 重復(fù)性實(shí)驗

取同一樣品6份，每份約1.0g制備供試品溶液，進(jìn)樣測定。結(jié)果得枸櫞酸峰面積的RSD值是0.72%，齊墩果酸峰面積的RSD值是0.39%。表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.3.5 加樣回收率實(shí)驗

按照“2.2.2”項下方法制備定容溶液，精密吸取1 mL，共取9份，以三組為一份，記為低、中、高三個濃度，分別按照表1所述精密加入對照品溶液，所得樣品按“2.1.1”下的色譜條件進(jìn)行測定，計算回收率和回收率的RSD值。結(jié)果得枸櫞酸和齊墩果酸的平均回收率分別為100.73%和97.98%，二者回收率的RSD分別為0.23%和0.52%。

2.4 驗證性實(shí)驗

按處方量分別稱取各味藥材3份，按照正交實(shí)驗優(yōu)化所得最佳工藝進(jìn)行3次平行實(shí)驗驗證。所得結(jié)果見表4。結(jié)果表明，采用優(yōu)選工藝制作所得樣品出膏率、枸櫞酸含量及齊墩果酸含量穩(wěn)定，表明該優(yōu)選出的加工工藝較穩(wěn)定。

表4 驗證實(shí)驗結(jié)果

3 結(jié) 論

實(shí)驗中比較了不同有機(jī)相甲醇、乙腈和不同濃度磷酸溶液(0.05%，1%)梯度洗脫對兩種成分分離情況的影響，從各成分的分離度、保留時間及峰面積綜合分析，最終選擇乙腈-0.05%磷酸溶液作為流動相進(jìn)行梯度洗脫，所得色譜圖中兩種化學(xué)成分離度較好，保留時間合適且基線平穩(wěn)。

實(shí)驗以浸膏、枸櫞酸和齊墩果酸的含量為考察指標(biāo)，預(yù)實(shí)驗比較了冷浸法、乙醇回流提取法和超聲提取法三種提取方法，最終選擇乙醇回流提取。通過正交實(shí)驗優(yōu)選最佳提取工藝為 90%乙醇回流提取0.5 h，料液比1:5，以期為烏梅解酒飲料的研發(fā)提供研究基礎(chǔ)。