SM22α基因啟動子區高甲基化與卵巢癌發生發展的相關性研究

趙芳 宋玉霞 孟煒 孟桐羽 周莎莎 王雪娟 郭樺

上皮性卵巢癌(EOC)是常見的女性生殖系統惡性腫瘤其病死率居于婦科惡性腫瘤首位[1]。卵巢癌發病十分隱匿，患者早期多無典型臨床癥狀，約70%的患者明確診斷時已是晚期[1]。卵巢癌極易發生侵襲、轉移，手術難以根除，且術后易復發，目前晚期卵巢癌患者5年生存率仍在30%左右[2]。因此，進一步探討卵巢癌的發生及卵巢癌細胞如何擴散至遠處器官的分子機制，對其預防、早期診斷及綜合治療具有重要的現實意義。平滑肌蛋白22α(SM22α)是一種腫瘤抑制因子。研究表明SM22α在多種腫瘤組織中表達下調，如：乳腺癌[3]、肺癌[4]、大腸癌[5]等。我們前期的研究也發現卵巢癌組織中SM22α的表達水平也顯著低于正常卵巢組織。然而其表達降低的調控機制尚不清楚。基因甲基化在組織特異性基因表達調控方面起重要作用，通過影響轉錄因子與基因啟動子上的結合位點結合，抑制基因轉錄[6]。本研究將應用甲基化特異性聚合酶鏈反應的方法檢測SM22α基因在卵巢癌組織中的甲基化狀態，探討SM22α基因啟動子的甲基化與其mRNA表達水平的相關性及其與卵巢癌發生、發展的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 病例組收集2015年12月至2019年10月期間于我院初治行腫瘤細胞減滅術的上皮性巢癌患者51例經術后病理確診為上皮性卵巢癌，且所有患者術前均未行新輔助化療。患者年齡28～73歲，平均年齡(53.5±6.4)歲。腫瘤分化程度：高、中分化27例、低分化24例；組織學類型：漿液性腺癌35例、子宮內膜樣癌10例、黏液性囊腺癌6例； FIGO 手術病理分期：Ⅰ期9例、Ⅱ期4例、Ⅲ期33例、Ⅳ期5例；淋巴結是否發生轉移：陽性16例，陰性35例。對照組收集同期因宮頸上皮內瘤變Ⅲ級或早期宮頸癌行全子宮雙附件切除的55例患者的卵巢組織，術后病理證實為正常卵巢組織。對照組年齡32～69歲，平均年齡(52.1±8.2)歲。病例組和對照組患者年齡匹配，統計分析無差異(P>0.05)。所有標本均在離體后迅速收集，并迅速轉入-80℃冰箱存放。病例資料收集及標本采集均經過患者本人知情并簽署同意書，本研究獲得我院倫理委員會批準通過。

1.2 主要試劑與儀器 PCR反應試劑盒和DNA提取試劑盒購買于美國Qiagen公司；亞硫酸氫鹽修飾試劑盒(EZ DNA Methylation-Gold)購買于美國Zymo Research公司；TRIzol試劑盒購買于北京索萊寶公司；RNA反轉錄試劑盒購買于美國Promega公司；Go Taq Green Master Mix試劑盒購買于上海凱杰；7500型熒光定量PCR儀為美國ABI公司產品。

1.3 檢測方法

1.3.1 組織DNA提取及甲基化特異性聚合酶鏈反應(MSP)：卵巢癌和正常卵巢組織DNA應用DNA提取試劑盒進行提取，其濃度及純度使用紫外分光光度計進行檢測。應用亞硫酸氫鹽修飾試劑盒(EZ DNA Methylation-Gold)將每個樣本的DNA(500 ng)進行修飾。然后進行PCR擴增，設計SM22α基因啟動子區甲基化、和非甲基化兩對引物。PCR的反應體系為20 μl：亞硫酸氫鹽修飾的DNA 1 μl、引物(上游引物、下游引物)各0.5 μl、Mix液 10 μl、最后添加去離子水至20 μl。PCR反應條件設定：95℃預變性5 min； 95℃變性30 s、58℃退火30 s、72℃延伸45 s，共35個循環；最后72℃延伸7 min。擴增產物在2%瓊脂糖凝膠上進行電泳，成像并判讀結果。結果判定：SM22α基因啟動子區甲基化引物擴增出條帶，SM22α基因啟動子區非甲基化引物未擴增出條帶，為SM22α基因啟動子區完全甲基化；相反，SM22α基因啟動子區甲基化引物未擴增出條帶，SM22α基因啟動子區非甲基化引物擴增出條帶，為SM22α基因啟動子區甲基化陰性；SM22α基因啟動子區甲基化和非甲基化引物均擴增出條帶，為部分甲基化，也記為SM22α基因啟動子區完全甲基化陽性。

1.3.2 總RNA提取及qRT-PCR反應：卵巢癌及正常卵巢組織總RNA應用TRIzol試劑按照說明書操作進行抽提，應用Nanodrop2000測定其含量和純度。應用RNA反轉錄試劑盒將提取的總RNA逆轉錄合成cDNA，放置于-20℃保存備用。qPCR擴增檢測SM22α目的基因 mRNA的水平，反應體系為：Green Master Mix 10.0 μl、上游引物各 1.4 μl、cDNA 模板1.0 μl、Rox 0.1 μl、去離子水 6.1 μl。qPCR反應條件：95℃預變性3 min；95℃變性15 s、58℃退火30 s、72℃延伸25 s，共40個循環；最后95℃變性15 s、60℃退火60 s、95℃延伸30 s。SM22α基因mRNA在各樣本中的相對表達量采用2-△△CT法進行計算獲得。見表1。

表1 MSP及qRT-PCR的引物序列

2 結果

2.1 SM22α基因在卵巢癌和正常卵巢組織中的甲基化狀態 利用MSP檢測了SM22α基因啟動子區在51例卵巢癌組織及55例正常卵巢組織中的甲基化情況，結果顯示：卵巢癌組織中甲基化狀態陽性有31例(60.8%)，甲基化狀態呈陰性為20例(39.2%)；正常卵巢組織中甲基化狀態陽性有12例(21.8%)，甲基化狀態陰性有43例(78.2%)。2組比較，差異有統計學意義(χ2=16.67，P<0.05)。見表2。

表2 2組SM22α基因甲基化狀態比較 例(%)

2.2 卵巢癌和正常卵巢組織中SM22α mRNA的表達情況 qRT-PCR結果顯示：卵巢癌組織中SM22α mRNA的相對表達量為0.73 ± 0.22，顯著低于其在正常卵巢組織中的表達(1.49±0.52)，2組比較，差異有統計學意義(t=-9.554，P<0.05)。見表3。

表3 2組SM22α基因mRNA表達比較

2.3 SM22α基因甲基化狀態與其mRNA表達的關系 SM22α甲基化陽性卵巢癌組織中其mRNA相對表達量為(0.66±0.18)，SM22α甲基化陰性卵巢癌組織中其mRNA相對表達量為(0.83±0.24)。t檢驗分析結果顯示：甲基化陽性組織中SM22α mRNA的表達水平顯著低于其在甲基化陰性組織中的表達(t=-2.751，P<0.05)。見表4。

表4 病例組中不同甲基化SM22α mRNA相對表達量比較

2.4 SM22α甲基化及表達與患者臨床病理參數的關系 SM22α在卵巢癌組織中甲基化狀態和SM22α在卵巢癌組織中mRNA的表達水平與患者的FIGO分期、淋巴結轉移顯著相關，差異有統計學意義(P<0.05)；而與年齡、病理類型、分級、手術殘余病灶等不相關(P>0.05)。見表5。

表5 SM22α基因啟動子區甲基化狀態及其mRNA表達與卵巢癌患者臨床病理參數之間的關系

3 討論

卵巢癌是女性生殖道系統致死率最高的惡性腫瘤，具有生長迅速、侵襲性強，易發生盆腹腔內種植播散等生物學特征。盡管近些年對卵巢癌的綜合治療取得較大進展，早期卵巢癌患者的5年生存率可達到80%～90%，但晚期患者5年生存率仍為30%～40%[7]。因此，尋找用于卵巢癌的早期篩查、診斷與預后評估等的生物標志物，同時尋找對卵巢癌新的治療分子靶點，對于臨床治療卵巢癌及改善患者預后具有重要意義。

細胞骨架在細胞的生命活動如細胞運動、細胞增殖、細胞分化以及細胞信號轉導等過程中起重要作用，其結構或功能的異常改變可能是腫瘤發生與發展的重要因素。SM22α作為一種actin結合蛋白，可通過與細胞骨架肌動蛋白結合來參與細胞骨架的重構，在細胞結構穩定和表型分化維持方面起重要作用[8]。SM22α不利于細胞的侵襲和遷移是通過增加actin的堅固性，從而防止細胞去極化來實現的。有報道顯示，SM22α在多種惡性腫瘤組織中的表達呈顯著降低狀態，如：乳腺癌[3]、肺癌[4]、大腸癌[5]等。Li等[9]發現SM22α在大腸癌組織中的表達水平顯著低于正常癌旁組織，表達下調的SM22α可增加癌細胞的增殖能力及侵襲能力，并減少癌細胞的凋亡；Nair等[10]報道了SM22α表達降低可以上調基質金屬蛋白酶9(MMP-9)的表達，從而增加腫瘤細胞的侵襲能力。這些結果均表明SM22α可能是一種新型的抑癌基因。然而目前筆者尚未發現國內外有SM22α與卵巢癌相關的 報道。

本實驗室前期研究發現與正常卵巢組織相比，SM22α在卵巢癌組織中的表達顯著降低低于，且SM22α的表達量與卵巢癌患者的淋巴結轉移相關。本研究進一步擴大樣本量，應用qRT-PCR檢測了卵巢癌組織及正常卵巢組織中SM22α的表達，并分析SM22α表達量與患者臨床病理特征的關系。本研究結果同樣顯示卵巢癌組織中SM22α的表達低于正常卵巢組織，這提示表達下調的SM22α可能在卵巢癌變過程中起作用。與淋巴結轉移陰性相比，SM22α在淋巴結轉移陽性患者的表達水平顯著下調，表明 SM22α表達可能與細胞的侵襲和遷移相關。通過擴大樣本量，本研究發現SM22α表達水平也與卵巢癌患者的FIGO分期相關，SM22α在Ⅲ、Ⅳ期患者中的表達水平顯著低于Ⅰ、Ⅱ期患者。臨床分期是判斷患者預后的重要因素，因此SM22α的表達水平有可能作為判斷卵巢癌患者預后的指標。

DNA甲基化是真核細胞中基因表達調控的主要方式之一，在胚胎發育、組織分化、腫瘤發生及其他復雜疾病中發揮重要作用。先前的研究表明SM22α在平滑肌細胞中的表達主要由甲基化狀態來調控[11]。此外，Zhao等[12]應用去甲基化試劑處理大腸癌細胞株HT29后，SM22α基因表達水平顯著升高，進一步表明SM22α基因啟動子區甲基化狀態可調控SM22α的表達。

為了明確卵巢癌組織中SM22α表達下調是否由甲基化調控，本研究進一步檢測了SM22α基因啟動子區甲基化狀態。與正常卵巢組織相比，SM22α基因啟動子區在卵巢癌組織中的甲基化陽性率顯著增加(P<0.05)，且甲基化水平與卵巢癌患者FIGO分期、淋巴轉移顯著相關(P<0.05)。此外，SM22α在甲基化陽性癌組織中mRNA的表達水平與甲基化陰性組織相比，顯著下調。這些結果與Sayar等[13]的結果相似，該研究報道了SM22α基因啟動子區在乳腺癌組織中呈高甲基化狀態，且其甲基化狀態與SM22α的表達水平呈顯著負相關性。我們的結果表明卵巢癌組織中SM22α基因啟動子區的高甲基化可能通過下調SM22α來增加癌細胞的侵襲能力和遷移能力，從而促進卵巢癌的發生發展[14-17]。

綜上所述，卵巢癌組織中SM22α的甲基化陽性率顯著升高，SM22α mRNA表達水平則顯著降低，且與患者的FIGO分期、淋巴結轉移情況相關，表明SM22α基因啟動子區高甲基化導致其表達下降可能在卵巢癌發生、發展中起重要作用。進一步深入研究SM22α的作用機制，有望為卵巢癌診斷和治療提供新的重要靶點。