circ_0003645靶向miR-578調控膠質瘤U251細胞增殖、遷移和侵襲的分子機制研究

潘彥波 張春雷 馬俊 王昶

惡性膠質瘤是臨床常見的難治性中樞神經系統腫瘤，其惡性程度高、難治愈，目前靶向治療可延長使患者的中位無進展生存期及中位總生存期[1,2]。因此，研究膠質瘤的分子機制，開發新的靶點以對膠質瘤的靶向治療具有重要意義。研究表明，circRNA在腫瘤發生和轉移中起重要作用，可抑制腫瘤發生，并可用作治療靶標[3]。研究報道乳腺癌組織和細胞系中circ_0003645的表達明顯增加，circ_0003645通過調節miR-139-3p/HMGB1軸促進乳腺癌的進展[4]。非小細胞肺癌患者組織中circ_0003645的過度表達與晚期TNM分期，陽性淋巴結浸潤和不良預后有關；干擾circ_0003645表達可抑制非小細胞肺癌細胞的惡性生物學行為[5]。然而circ_0003645在膠質瘤中的作用，其對膠質瘤U251細胞增殖、遷移和侵襲的影響及機制尚不清楚。研究報道miR-578上調可抑制膠質瘤細胞增殖，促進細胞凋亡[6]。在線生物學軟件預測發現circ_0003645與miR-578有結合位點，但circ_0003645與miR-578的關系及circ_0003645調控miR-578影響膠質瘤進展尚不清楚。本實驗旨在研究circ_0003645對膠質瘤U251細胞增殖、遷移和侵襲的影響及機制是否與miR-578有關。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 選取2017年1月至2020年12月我院病理科存檔且已確診腦膠質瘤的組織標本35例，其中男18例，女17例；年齡18～72歲，平均(39.7±2.1)歲。通過內減壓術獲得正常腦組織標本35例作為對照，其中男19例，女16例；年齡18～56歲，平均(37.4±1.2)歲。所有患者術前無放化療史。患者均知情且同意。

1.2 細胞與主要試劑 膠質瘤細胞株U251購自美國ATCC；RPMI-1640培養基購自美國Gibco公司；Trizol試劑、熒光定量試劑盒購自美國Progema公司；細胞計數試劑盒8(CCK-8)購自南京賽泓瑞生物科技有限公司；Transwell小室、Matrigel購自美國BD公司；蛋白提取試劑盒購自上海振譽生物科技有限公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自美國AAT Bioquest公司。

1.3 細胞轉染與分組 膠質瘤細胞株U251用RPMI-1640培養基培養，將circ_0003645干擾表達載體質粒及陰性對照、miR-578模擬物及陰性對照轉染至U251細胞中，記為si-circ_0003645組、si-NC組、miR-578組、miR-NC組；將circ_0003645干擾表達載體質粒分別與miR-578抑制劑及陰性對照轉染至U251細胞中，記為si-circ_0003645+anti-miR-578組、si-circ_0003645+anti-miR-NC組。

1.4 實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測circ_0003645和miR-578的表達水平 提取膠質瘤組織、正常腦組織及各組細胞的總RNA，反轉錄成cDNA，以GAPDH和U6為內參進行PCR，相對表達量用2-ΔΔCt法計算。

1.5 CCK-8檢測細胞活性 各組細胞培養48 h，按試劑盒說明加入 CCK-8試劑，培養2 h，用酶標儀檢測450 nm處的吸光度值(OD)。

1.6 克隆形成實驗檢測細胞克隆形成數 將細胞制成1×104個/ml細胞懸液，以每孔200個細胞接種于6孔板，培養2周后用PBS清洗細胞，用甲醇固定細胞，用吉姆薩染色30 min，在光學顯微鏡下計數>50個細胞的集落。

1.7 劃痕實驗檢測細胞劃痕愈合率 各組細胞消化后接種于培養板，過夜細胞鋪滿后用槍頭直線劃痕，用PBS沖洗劃下的細胞，換液后繼續培養，在培養0 h和48 h后拍照觀察，用Image-Pro Plus6.0軟件計算劃痕愈合率。

1.8 Transwell檢測侵襲細胞數 Transwell小室上室加入100 μl稀釋好的Matrigel，凝固后加100 μl細胞懸液，下室加500 μl含血清培養液，培養24 h，用0.1%結晶紫染色30 min，棉簽擦拭掉上層未穿過基底膜的細胞，光學顯微鏡(×200)下隨機選擇5個視野，拍照并計數。

1.9 蛋白質印跡(Western blot)法檢測蛋白表達 提取細胞總蛋白，取50 μl蛋白進行SDS-PAGE電泳，轉至PVDF膜，用封閉液將膜封閉，將封閉后的膜置于含有一抗的雜交袋中置于4℃冰箱中過夜，然后經膜置于含有二抗的雜交袋中在室溫下孵育1 h，顯影、定影后用Image J分析蛋白條帶灰度值，計算蛋白表達水平。

1.10 雙熒光素酶報告實驗 將circ_0003645的野生型和突變型熒光素酶載體分別與miR-NC或miR-578共轉染至U251細胞，按試劑盒說明檢測U251細胞的熒光素酶活性。將pcDNA、pcDNA-circ_0003645、si-NC、si-circ_0003645轉染至U251細胞，采用qRT-PCR檢測miR-578的表達水平。

2 結果

2.1 circ_0003645和miR-578在膠質瘤組織中的表達 膠質瘤組織中circ_0003645表達水平高于正常腦組織，而miR-578表達水平低于正常腦組織(P<0.05)。見表1。

表1 circ_0003645和miR-578在膠質瘤組織中的表達

2.2 干擾circ_0003645表達對膠質瘤U251細胞增殖、遷移和侵襲的影響 與si-NC組比較，si-circ_0003645組circ_0003645表達水平降低，細胞活性降低，細胞克隆形成數減少，劃痕愈合率降低，侵襲細胞數減少，E-cadherin表達水平升高，N-cadherin表達水平降低(P<0.05)。見圖1，表2。

圖1 干擾circ_0003645表達后遷移侵襲相關蛋白的表達

表2 干擾circ_0003645表達對膠質瘤U251細胞增殖、遷移和侵襲的影響

2.3 miR-578過表達對膠質瘤U251細胞增殖、遷移和侵襲的影響 過表達miR-578后，miR-578表達水平升高，U251細胞的活性降低，細胞克隆形成數減少，劃痕愈合率降低，侵襲細胞數減少，E-cadherin表達水平升高，N-cadherin表達水平降低(P<0.05)。見表3，圖2。

表3 miR-578過表達對膠質瘤U251細胞增殖、遷移和侵襲的影響

圖2 miR-578過表達后遷移侵襲相關蛋白表達

2.4 circ_0003645靶向調控miR-578的表達 Circular RNA Interactome預測顯示circ_0003645與miR-578含有互補的核苷酸序列。WT-circ_0003645與miR-578共轉染的U251細胞熒光素酶活性降低(P<0.05)；過表達circ_0003645后，miR-578表達水平降低；抑制circ_0003645表達后，miR-578表達水平升高(P<0.05)。見表4、5,圖3。

表4 circ_0003645野生型與突變型載體與miR-578或miR-NC共轉染后的細胞熒光素酶活性

表5 circ_0003645調控miR-578的表達

圖3 circ_0003645的序列中含有與miR-578互補的核苷酸序列

2.5 下調miR-578表達逆轉了干擾circ_0003645表達對膠質瘤U251細胞增殖、遷移和侵襲的作用 與si-circ_0003645+anti-miR-NC組比較，si-circ_0003645+anti-miR-578組miR-578表達水平降低，細胞活性升高，細胞克隆形成數增加，劃痕愈合率升高，侵襲細胞數增加，E-cadherin表達水平降低，N-cadherin表達水平升高，組間差異均有統計學意義(P<0.05)。見表6，圖4。

表6 下調miR-578表達逆轉了干擾circ_0003645表達對膠質瘤U251細胞增殖、遷移和侵襲的作用

圖4 遷移侵襲相關蛋白表達

3 討論

膠質瘤是惡性腦腫瘤的最常見類型，分子靶向治療可能是治療膠質瘤的一種新穎策略[7,8]。研究表明多種circRNA參與調控膠質瘤的惡性生物學行為[9]。研究報道CircNFIX通過調節miR-378e/RPN2軸促進神經膠質瘤的進展[10]。Circ_0005075通過下調SIRT1刺激神經膠質瘤的增殖和轉移[11]。circ_0008225通過使miR-890海綿化并促進ZMYND11表達來抑制神經膠質瘤的發生[12]。

本實驗結果顯示，膠質瘤組織中circ_0003645表達水平升高，提示circ_0003645可能在膠質瘤中起促癌作用。干擾circ_0003645表達后，U251細胞活性及劃痕愈合率降低，細胞克隆形成數及侵襲細胞數減少，E-cadherin表達水平升高，N-cadherin表達水平降低；表明擾circ_0003645表達抑制了U251細胞的增殖、遷移和侵襲。

研究報道miR-578過表達可抑制乳腺癌細胞活力，集落形成，遷移，侵襲，并促進細胞凋亡[13]。本實驗結果顯示，膠質瘤組織中miR-578表達水平降低；過表達miR-578可降低U251細胞活性及劃痕愈合率，減少細胞克隆形成數及侵襲細胞數。此外，研究報道circ_001621通過使miR-578海綿化并調節VEGF表達來促進骨肉瘤細胞增殖和遷移[14]。circ_0005785上調通過miR-578/APRIL軸促進肝癌細胞的細胞生長和轉移[15]。說明circRNA可通過調控miR-578影響腫瘤進展。本實驗發現circ_0003645可靶向調控miR-578的表達；而下調miR-578表達逆轉了干擾circ_0003645表達對膠質瘤U251細胞增殖、遷移和侵襲的作用。

綜上所述，干擾circ_0003645表達通過靶向上調miR-578抑制膠質瘤U251細胞增殖、遷移和侵襲。