普魯卡因調節lncRNA TTN-AS1表達對胃癌細胞惡性生物學行為的影響

韋玲 楊凱 劉煥 程棟

胃癌早期無明顯癥狀，發病隱匿，多數胃癌患者確診時已處于晚期[1]。胃癌的發生發展是一個包含癌基因激活和抑癌基因失活的多基因、多階段的復雜過程，如何激活抑癌基因或抑制癌基因已成為抗腫瘤基因治療研究特點。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是一類長度>200 nt的RNA分子，可通過特異性結合miRNA，抑制miRNA功能，間接調控蛋白編碼基因，從而影響多種腫瘤細胞生長[2]。肌聯蛋白反義RNA1(titin antisense RNA1，TTN-AS1)是一條發揮促癌作用的lncRNA，在肺癌、甲狀腺癌等多種腫瘤中呈現高表達，可促進腫瘤進展[3,4]。有研究表明，普魯卡因可抑制胃癌細胞增殖，促進細胞凋亡，但機制尚未明確[5]。有研究顯示，普魯卡因可通過上調miR-133b抑制骨肉瘤細胞增殖和侵襲能力，促進細胞凋亡[6]。miR-133b是miRNA家族成員之一，有研究表明，胃癌組織及細胞miR-133b低表達，過表達miR-133b可抑制胃癌細胞生長[7]。lncRNA TTN-AS1可靶向調控miR-133b影響食管癌進展和轉移[8]。鑒于此，本研究旨在普魯卡因調節lncRNA TTN-AS1對胃癌細胞增殖、侵襲和凋亡的影響，為胃癌治療提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 人胃癌SGC-7901細胞購自美國ATCC公司。RPMI 1640培養基、胰蛋白酶、胎牛血清、Opti-MEM培養基均購自美國Gibco公司；Trizol試劑盒、Lipofectamine 2000試劑盒均購自美國Invitrogen公司；MTT、DMSO均購自美國Sigma公司；Transwell小室購自美國Coming公司；Annexin V-FITC/PI雙染細胞凋亡試劑盒、流式細胞儀均購自美國BD公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自美國Promega公司；熒光定量PCR儀購自美國ABI公司；酶標儀購自美國Bio-Rad公司。

1.2 細胞培養 SGC-7901細胞常規復蘇后，使用含10% FBS的RPMI 1640培養基培養，培養環境為5%體積分數CO2、37℃、飽和濕度孵箱。為單層貼壁生長，2～3 d換液1次，細胞達80%～90%匯合度時進行傳代。取對數生長期的細胞用于實驗。

1.3 細胞轉染 轉染前1 d，取對數生長期的SGC-7901細胞，制備成細胞懸液，細胞計數后以1×106個/孔接種于6孔板，放置于5%體積分數CO2、37℃孵箱中培養，24 h后顯微鏡下觀察，細胞達60%～70%融合度時可進行轉染。轉染參照Lipofectamine 2000試劑盒說明，使用Opti-MEM培養基稀釋lipo 2 000轉染試劑，作為A液；使用Opti-MEM培養基稀釋TTN-AS1 siRNA(si-TTN-AS1)及陰性對照(si-NC)、TTN-AS1過表達載體(pcDNA-TTN-AS1)及空載體對照(pcDNA)、miR-133b inhibitor(anti-miR-133b)及anti-NC，作為B液。混合A液和B液，室溫孵育20 min，以形成復合物。將混合液加入相應的孔內，放置于培養箱孵育5 h，更換為新的完全培養基，繼續培養48 h，用于實驗研究。

1.4 實驗分組處理 為研究普魯卡因對SGC-7901細胞增殖、侵襲、凋亡及TTN-AS1和miR-133b表達影響，將普魯卡因溶液稀釋為0.1、0.5和1.0 mmol/L，使用不同濃度普魯卡因處理細胞48 h。為研究TTN-AS1靶向miR-133b對SGC-7901細胞增殖、侵襲和凋亡影響，將細胞分為si-NC組、si-TTN-AS1組、si-TTN-AS1+anti-NC組、si-TTN-AS1+anti-miR-133b組。為研究普魯卡因調節TTN-AS1對SGC-7901細胞增殖、侵襲和凋亡影響，將細胞分為對照組、普魯卡因組、普魯卡因+si-NC組、普魯卡因+si-TTN-AS1組。

1.5 細胞增殖實驗 以5 000個/孔接種對數生長期的SGC-7901細胞于96孔板，每孔100 μl細胞懸液，置于5%體積分數CO2、37℃、飽和濕度培養箱24 h，按照上述分組處理細胞，每組設置5個復孔。收集處理48 h的各組細胞，在每孔中加5 mg/ml的MTT溶液20 μl，于培養箱繼續孵育4 h。終止培養，在每孔加DMSO 150 μl，避光微震蕩20 min，使結晶物溶解。酶標儀波長設置為490 nm，檢測各孔吸光度值(OD值)。實驗重復3次。

1.6 細胞侵襲檢測 使用經無血清培養基稀釋的Matrigel基質膠包被Transwell小室底部，放置于37℃恒溫培養箱4～5 h，使基質膠凝固。取對數生長期的SGC-7901細胞，按照上述分組分別處理細胞48 h，無血清培養基重懸細胞，計數，調整細胞濃度。取200 μl細胞懸液(約2×104個/孔)，加入 Transwell上室中，Transwell下室加含FBS的培養基500 μl。置于常規條件下培養24 h，取出小室，棉簽輕輕拭去上室未侵襲細胞，4%多聚甲醛固定，0.1%結晶紫染色。顯微鏡下隨機選擇5個視野，記錄穿過膜的細胞數。實驗重復3次。

1.7 細胞凋亡檢測 收集按照上述分組處理48 h的細胞，胰酶消化細胞，并將細胞濃度調整為5×105個/ml。預冷PBS洗滌細胞2次，離心，收集細胞沉淀。根據Annexin V-FITC/PI雙染細胞凋亡試劑盒說明，使用500 μl的binding buffer重懸細胞，然后在細胞懸液中加Annexin V-FITC染液和PI染液各5 μl，混勻后室溫避光靜置15～20 min，之后在1 h內通過流式細胞儀檢測。實驗重復3次。

1.8 TTN-AS1和miR-133b表達檢測 收集經不同濃度普魯卡因處理48 h的SGC-7901細胞，采用Trizol法提取細胞總RNA，NanoDrop檢測RNA樣本的吸光度值，吸光度值260/280在1.8～2.0表明RNA純度較好。將合格的RNA逆轉錄為cDNA，以cDNA為模板進行qPCR擴增反應，反應體系為20 μl，每組設置5個復孔，反應體系配置及反應條件設置參照PCR試劑盒說明。所有引物序列為：GAPDH F 5’-GTCACCTTCACCGTTCCAGTTTT-3’，R 5’-CTTAGTTGCGTTACACCCTTTCTT-3’；TTN-AS1 F 5’-GCCAGGTAGAGTTGCAGGTT-3’，R 5’-GAAGCTGCTGCGGATGAATG-3’。miR-133b F 5’-GCGCTTTGGTCCCCTTC-3’，R 5’-CAGTGCAGGGT-CCGAGGT-3’；U6 F 5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，R 5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。其中GAPDH為TTN-AS1內參，U6為miR-133b內參。所得結果采用2-△△Ct法計算。實驗重復3次。

1.9 雙熒光素酶報告實驗 構建TTN-AS1 3’ UTR的野生型(WT)及突變型(MUT)報告質粒，將質粒與miR-133b mimics及miR-NC共轉染至SGC-7901細胞。轉染48 h后，吸取各孔培養基，PBS洗滌細胞3次，加入200 μl 1×PLB，室溫裂解細胞20 min。離心，轉移上清至96孔板中，每組3個復孔。上機檢測前，分別加Luciferase Assay Regent和1×Stop&Glo?Regent各100 μl，用于螢火蟲熒光素酶及海腎熒光素酶活性檢測。計算螢火蟲熒光素酶/海腎熒光素酶活性值，作為各組細胞熒光素酶活性。

2 結果

2.1 普魯卡因對SGC-7901細胞TTN-AS1和miR-133b表達的影響 qRT-PCR檢測結果顯示，普魯卡因作用下的SGC-7901細胞TTN-AS1表達降低，miR-133b表達升高，且隨著普魯卡因濃度增加TTN-AS1表達逐漸降低，miR-133b表達逐漸升高，與對照組比較差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 qRT-PCR檢測不同濃度普魯卡因處理的SGC-7901細胞TTN-AS1和miR-133b表達

2.2 TTN-AS1和miR-133b的靶向關系 生物信息學預測結果顯示，TTN-AS1 3’UTR區與miR-133b 5’UTR有連續結合位點。雙熒光素酶報告基因檢測結果顯示，miR-133b mimics與TTN-AS1 3’ UTR野生型質粒共轉染后熒光素酶活性明顯降低(P<0.05)，而與TTN-AS1 3’ UTR突變型質粒共轉染后熒光素酶活性無明顯變化(P>0.05)。qRT-PCR結果顯示，過表達TTN-AS1的SGC-7901細胞miR-133b明顯降低，而抑制TTN-AS1表達的SGC-7901細胞miR-133b明顯升高(P<0.05)。提示TTN-AS1可負調控miR-133b的表達。見圖1，表2、3。

圖1 生物信息學預測的TTN-AS1和miR-133b的結合位點

表2 TTN-AS1 WT/MUT與miR-133b mimics共轉染SGC-7901細胞后的熒光素酶活性

表3 過表達或抑制TTN-AS1的SGC-7901細胞miR-133b表達

2.3 普魯卡因對SGC-7901細胞增殖、侵襲和凋亡的影響 MTT、Transwell小室及流式細胞術檢測結果顯示，普魯卡因對SGC-7901細胞增殖和侵襲能力抑制及凋亡促進作用隨著濃度遞增而增加，與對照組比較差異有統計學意義(P<0.05)。見圖2，表4。

圖2 不同濃度普魯卡因對SGC-7901細胞凋亡影響

表4 不同濃度普魯卡因對SGC-7901細胞增殖、侵襲和凋亡影響

2.4 TTN-AS1靶向miR-133b對SGC-7901細胞增殖、侵襲和凋亡的影響 各組細胞增殖、侵襲和凋亡檢測結果顯示，與si-NC組比較，si-TTN-AS1組和si-TTN-AS1+anti-NC組細胞增殖和侵襲能力明顯降低，凋亡率明顯升高(P<0.05)，與si-TTN-AS1+anti-NC組比較，si-TTN-AS1+anti-miR-133b組細胞增殖和侵襲能力明顯升高，凋亡率明顯降低(P<0.05)。見圖3，表5。

圖3 TTN-AS1靶向miR-133b對SGC-7901細胞凋亡的影響

表5 TTN-AS1靶向miR-133b對SGC-7901細胞增殖、侵襲和凋亡的影響

2.5 普魯卡因調節 TTN-AS1表達對SGC-7901細胞增殖、侵襲和凋亡的影響 轉染TTN-AS1 siRNA下調SGC-7901細胞TTN-AS1表達，并結合1.0 mmol/L普魯卡因處理細胞，細胞增殖、侵襲和凋亡檢測結果顯示，普魯卡因可明顯抑制SGC-7901細胞增殖和侵襲能力，促進細胞凋亡(P<0.05)，普魯卡因結合TTN-AS1 siRNA干預對細胞增殖和侵襲抑制及凋亡促進作用更明顯。見圖4，表6。

圖4 普魯卡因單獨或聯合TTN-AS1 siRNA對SGC-7901細胞凋亡的影響

表6 普魯卡因單獨或聯合TTN-AS1 siRNA對SGC-7901細胞增殖、侵襲和凋亡的影響

3 討論

普魯卡因是傳統的化療藥物之一，在術中也作為局部麻醉劑使用，多項研究表明，普魯卡因可抑制腫瘤細胞生長，如Li等[9]研究顯示，普魯卡因可通過調節RhoA抑制ERK/MAPK/FAK通路從而降低結腸癌細胞的增殖和遷移能力；方潔等[10]研究顯示，普魯卡因聯合肌成束蛋白1可抑制膀胱癌細胞增殖，阻滯細胞周期，且誘導細胞凋亡。以上研究提示普魯卡因在腫瘤中發揮的重要作用。本研究以胃癌SGC-7901細胞為實驗對象，使用0.1 mmol/L、0.5 mmol/L和1.0 mmol/L的普魯卡因處理SGC-7901細胞，細胞增殖和侵襲能力明顯降低，凋亡率明顯升高，且呈現濃度依賴性，其中普魯卡因對細胞增殖和凋亡影響與Li等[5]的研究結果一致。

有研究發現，普魯卡因可通過調節miRNA影響腫瘤細胞生長，如馬寶豐等[11]研究顯示，普魯卡因可通過miR-15a-5p/PI3K-AKT3途徑抑制乳腺癌細胞增殖、侵襲和遷移能力。內源性競爭ceRNA是lncRNA行使生物學功能的機制之一[12]，普魯卡因是否可調節lncRNA影響胃癌細胞生長尚未清楚。本研究結果顯示，普魯卡因可呈濃度依賴性抑制TTN-AS1表達，增強miR-133b表達。提示普魯卡因可能通過調節TTN-AS1/miR-133b影響胃癌細胞生長。多項研究表明，腫瘤發生發展與lncRNAs密切相關，其表達異常可促進腫瘤進展[13-15]。lncRNA TTN-AS1是新近發現的lncRNA，已被報道在多種腫瘤中發揮促癌作用，如Li等[16]研究顯示，TTN-AS1可通過調節miR-376a/DKK-1分子軸促進骨肉瘤細胞生長。Dong等[17]研究顯示，抑制TTN-AS1表達可明顯降低胃癌細胞增殖、侵襲和遷移能力，促進細胞凋亡，機制與調節miR-376b-3p/KLF12有關。研究表明，miRNA幾乎參與胃癌發生發展、凋亡、增殖、耐藥、轉移等多個環節[18,19]。miR-133b是miRNA家族成員之一，有研究顯示，過表達miR-133b可抑制胃癌細胞增殖、侵襲和遷移能力[20]； miR-133b可靶向調節GSTP1逆轉肺癌順鉑耐藥[21]。生物信息學預測發現TTN-AS1與miR-133b存在連續的結合位點，但 TTN-AS1是否可調節miR-133b影響胃癌細胞生長尚未明確。本研究結果顯示，過表達TTN-AS1可明顯促進miR-133b表達，而抑制TTN-AS1表達可增強miR-133b表達，提示TTN-AS1可負調控miR-133b的表達，抑制TTN-AS1表達可明顯降低胃癌細胞增殖、侵襲和遷移能力，促進細胞凋亡，而下調miR-133b表達可減弱抑制TTN-AS1對細胞生長的影響，提示TTN-AS1可靶向調節miR-133b影響胃癌細胞生長。進一步在細胞轉染TTN-AS1 siRNA后結合普魯卡因處理細胞，發現聯合使用對細胞增殖、侵襲和凋亡的影響強于單獨使用。提示普魯卡因可調節TTN-AS1影響胃癌細胞生長。

綜上所述，TTN-AS1可靶向調節miR-133b抑制胃癌SGC-7901細胞增殖和侵襲，促進細胞凋亡。普魯卡因可抑制SGC-7901細胞增殖和侵襲，促進細胞凋亡，機制可能是引起TTN-AS1表達改變進而調控miR-133b表達，從而影響胃癌細胞生長。本研究為普魯卡因在胃癌中機制研究提供了一定的理論基礎。