衍生-氣相色譜法測定食品中亞硝酸鹽*

溫伊蕾,劉國平,丁麗燕

(中山市疾病預(yù)防控制中心，廣東 中山 528403)

亞硝酸鹽和硝酸鹽是自然界中普遍存在的含氮無機(jī)化合物。硝酸鹽的重要來源是由自然界中的氮循環(huán)以及人類的活動所構(gòu)成。在其形成的過程中，由于微生物的作用，常伴有亞硝酸鹽的產(chǎn)生。常見的亞硝酸鹽主要有亞硝酸鈉和亞硝酸鉀，外觀與食鹽類似，呈白色至淡黃色，粉末或顆粒狀，無臭，味微咸，易潮解和溶于水，因其獨(dú)特的化學(xué)屬性常被作為食品的添加劑、防腐劑和發(fā)色劑，廣泛應(yīng)用于食品加工中。一般情況下，人體中的亞硝酸鹽主要是食物和飲水中的硝酸鹽在口腔及胃中細(xì)菌的作用下轉(zhuǎn)化而來[1]。亞硝酸鹽還可以通過一定途徑被還原為一氧化氮。攝入含有低水平亞硝酸鹽的食物可補(bǔ)充人體內(nèi)的亞硝酸鹽。但由于其物理性質(zhì)與食鹽相類似，日常管理不善和使用不當(dāng)導(dǎo)致誤食中毒事件時(shí)有發(fā)生。人攝入0.3～0.5 g亞硝酸鹽即可引起中毒，一次性食入超過3 g則可導(dǎo)致死亡[2]。人體攝入亞硝酸鹽后，體內(nèi)過量的亞硝酸鹽可使血液中二價(jià)鐵離子氧化為三價(jià)鐵離子，使正常血紅蛋白轉(zhuǎn)化為高鐵血紅蛋白，失去攜氧能力，引起組織缺氧，發(fā)生中毒[3]。亞硝酸鹽中毒的潛伏期長短不等，視攝入亞硝酸鹽的數(shù)量、濃度而定。一般潛伏期為1～3小時(shí)，長者可達(dá)1～2天，短者僅10分鐘左右。通常中毒表現(xiàn)為發(fā)紺(皮膚或粘膜呈現(xiàn)青紫色)、胸悶、呼吸困難、呼吸急促、頭暈、頭痛、心悸等。中毒嚴(yán)重者還可出現(xiàn)惡心、嘔吐、心率變慢、心律不齊、煩躁不安、血壓降低、肺水腫、休克、驚厥或抽搐、昏迷，最后可因呼吸、循環(huán)衰竭而死亡[4]。馬巖、王霄曄等的研究表明[5]，近年來在全國性化學(xué)食物中毒事件中，由誤食誤用亞硝酸鹽而引發(fā)的食物中毒事件占所有化學(xué)性食物中毒事件的比例高達(dá)50%。

目前，常用的食品中亞硝酸鹽檢測方法有分光光度法、離子色譜法、熒光法、電化學(xué)法、化學(xué)發(fā)光法、示波極譜法等[4-12]，而國家標(biāo)準(zhǔn)對日常食品中亞硝酸鹽限量和檢測方法都有了相應(yīng)的規(guī)定。但是各方法都存在一定的局限性，其中分光光度法在日常檢測過程中亞硝酸鹽含量較大時(shí),過量的亞硝酸鹽對耦合反應(yīng)產(chǎn)生影響，使耦合的組分發(fā)生氧化、硝化反應(yīng)，容易出現(xiàn)褪色現(xiàn)象。在中毒事件發(fā)生時(shí)，往往樣品的亞硝酸鹽含量都比較大，容易造成結(jié)果的誤判。離子色譜法也存在操作步驟繁瑣，干擾因素多，檢測范圍窄等缺點(diǎn)[6]。熒光法對環(huán)境因素較敏感,干擾因素較多且由于發(fā)生熒光強(qiáng)度的物質(zhì)較少,此方法應(yīng)用范圍較窄[7-8]。電化學(xué)法對于電極的選擇及電極表面的修飾材料要求較嚴(yán)苛,實(shí)驗(yàn)方法不穩(wěn)定性大[9]。化學(xué)發(fā)光法則需要高燃燒溫度來保持一氧化氮的存在，且氣相化學(xué)發(fā)光法檢測對于還原劑的強(qiáng)度有很大的選擇性要求[10]。示波極譜法分析技術(shù)后樣品的峰型復(fù)雜，需要耗時(shí)分析，影響檢測時(shí)效[4]。因此，在食物中毒事件中的檢測采用快速定性和定量方法，對臨床救治、保障人民群眾生命安全以及監(jiān)督管理工作有著十分重要的意義。

本文研究利用在酸性條件下亞硝酸鹽與環(huán)己基氨基磺酸鈉作用生成環(huán)己基氨基磺酸酯，建立食品中亞硝酸鹽氣相色譜測定方法，為日常食品檢測和食物中毒事件檢測提供一種快速、靈敏、準(zhǔn)確的方法。

1 材料與方法

1.1 儀 器

6890N氣相色譜儀，安捷倫公司；FID檢測器，安捷倫公司；石英毛細(xì)管柱HP-5(30 m×0.32 mm×0.25 μm)，安捷倫公司；Milli-Q Advantage A10超純水儀，美國密理博公司；AB265-S電子天平(感量0.0001g)，瑞士METTLER TOLEDO 公司；G560E 渦旋混合器，美國SCIENTIFIC INDUSTRIES 公司。

1.2 試 劑

環(huán)己基氨基磺酸鈉(純度>98%)，TCI化成工業(yè)發(fā)展有限公司；濃硫酸(分析純)，廣州化學(xué)試劑廠；正己烷(色譜純)，美國默克公司；氯化鈉(分析純)，天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司；乙酸鋅(分析純)，廣州化學(xué)試劑廠；亞鐵氰化鉀(分析純)，廣州化學(xué)試劑廠；硼砂(分析純)，廣州化學(xué)試劑廠。

1.3 色譜條件

色譜柱：HP-5毛細(xì)管柱，30 m×0.32 mm×0.25 μm；溫度：進(jìn)樣口200 ℃，檢測器250 ℃；柱溫：80 ℃恒溫；空氣：400 mL/min;氫氣：40 mL/min；載氣：高純N2，恒流30 mL/min；進(jìn)樣方式：分流進(jìn)樣，分流比20:1；進(jìn)樣體積：1.0 μL。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 方法原理

在硫酸介質(zhì)中，樣品中的亞硝酸鹽與環(huán)己基氨基磺酸鈉生成環(huán)己醇亞硝酸酯，經(jīng)正己烷提取后，用帶FID檢測器的氣相色譜儀進(jìn)行定量分析。

1.4.2 樣品處理方法

將樣品放置到勻漿機(jī)中進(jìn)行打碎，取5 g樣品放入三角瓶中，再加純水25 mL充分振搖混勻，經(jīng)過過濾，將濾液置入50 mL帶蓋離心管中，再把帶蓋離心管放置入冰浴5 min后，迅速把5 mL正己烷、2.5 mL環(huán)己基氨基磺酸鈉、2.5 mL硫酸溶液準(zhǔn)確加入離心管后，蓋緊、搖勻并在冰浴中放置30 min，后加入2.5 g氯化鈉振搖，離心取上清液冷藏備用。

1.4.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線

分別吸取適量的亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液于6個10 mL容量瓶中，用適量的超純水配制成0，5.00 μg/mL，10.0 μg/mL，20.0 μg/mL，80.0 μg/mL，100.0 μg/mL(相當(dāng)于0，50 μg，100 μg，200 μg，800 μg，1000 μg亞硝酸鈉)，同樣品相同步驟衍生化后，上機(jī)檢測。

2 結(jié)果討論

2.1 線性范圍和檢出限

將標(biāo)準(zhǔn)系列溶液按照本方法色譜條件進(jìn)行測定，亞硝酸鹽衍生后生成的環(huán)己醇亞硝酸酯的保留時(shí)間為3.036 min(圖1)。本方法在0～1000 μg線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(圖2)，相關(guān)系數(shù)0.9993，回歸方程Y=0.09232X-0.7558，檢出限為0.70 μg。若取樣5 g樣品，測得亞硝酸鹽的最低檢出濃度為0.14 mg/kg。因國標(biāo)GB 5009.33-2016中的分光光度法通過筆者研究發(fā)現(xiàn)，在亞硝酸鹽含量大于500 μg時(shí)，過量的亞硝酸鹽對耦合反應(yīng)產(chǎn)生影響，使耦合的組分發(fā)生氧化、硝化反應(yīng)，繼而出現(xiàn)褪色現(xiàn)象，導(dǎo)致其影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。為此，使用本方法后，因其具有線性范圍廣的特性，則可完全避免褪色現(xiàn)象發(fā)生，進(jìn)一步提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

圖1 環(huán)己醇亞硝酸酯色譜圖Fig.1 Gas chromatogram of cyclohexanol nitrite

圖2 亞硝酸鹽含量標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 The standard curve of nitrite

2.2 加標(biāo)回收試驗(yàn)和精密度試驗(yàn)

以咸菜為例，稱取同一均勻絞碎不含本底的咸菜樣品共18份，分成3組，每組分別加入160 μg、420 μg、800 μg亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液，按本文所述方式進(jìn)行檢測，連續(xù)開展6次實(shí)驗(yàn)，取得結(jié)果見表1。

表1 加標(biāo)回收率和精密度試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.3 衍生條件優(yōu)化試驗(yàn)

通過加入10% 環(huán)己基氨基磺酸鈉10 μL、50 μL、100 μL、250 μL、500 μL、1000 μL、2000 μL用本試驗(yàn)方法進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示在500 μL以上時(shí)，其信號響應(yīng)不再隨環(huán)己基氨基磺酸鈉的含量增加而升高，因此本試驗(yàn)選擇加入500 μL的10%環(huán)己基氨基磺酸鈉進(jìn)行測定。

2.4 衍生溫度的影響

將已知濃度的樣品按本試驗(yàn)方法在0 ℃冰浴、25 ℃室溫、60 ℃水浴、100 ℃加熱的條件下進(jìn)行反應(yīng)后，在同一色譜條件下進(jìn)行分析，其結(jié)果表明在冰浴條件下信號響應(yīng)值最大，因此選擇在冰浴下進(jìn)行本試驗(yàn)。

2.5 本法與國標(biāo)方法比較

用本試驗(yàn)方法與國標(biāo)分光光度法對30個不同類別樣品進(jìn)行檢測，其結(jié)果見表2。同時(shí)用SPSS13.0軟件對衍生-氣相色譜法與分光光度法檢測結(jié)果作兩配對樣品t檢驗(yàn)(T-Ttest)的統(tǒng)計(jì)分析，得到t=1.397，p=0.173，按α=0.05水準(zhǔn)，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說明兩種方法檢測同一樣品中亞硝酸鹽沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

表2 本方法與分光光度法測定亞硝酸鹽結(jié)果比較

3 結(jié) 論

通過本試驗(yàn)建立了衍生-氣相色譜測定食品中亞硝酸的方法，相對于其它的食品中亞硝酸鹽檢測方法分光光度法、離子色譜法、熒光法、電化學(xué)法、化學(xué)發(fā)光法、示波極譜法等，后者都存在一定的局限性，操作步驟繁瑣，干擾因素多，檢測范圍窄的缺點(diǎn)，容易造成結(jié)果的誤判。而衍生-氣相色譜測定食品中亞硝酸的方法，由于其具有簡化前處理步驟，靈敏度高、線性范圍廣的特性，且準(zhǔn)確度、精密度、回收率均能滿足檢測需求，并可用于食物中毒事件發(fā)生時(shí)的亞硝酸鹽測定，對于臨床救治，尤其是保障人民群眾生命安全以及監(jiān)督管理工作有著十分重要的作用。綜上所述，對食品中亞硝酸鹽中的檢測方法多很多種，每一種方法都有其優(yōu)點(diǎn)，也有其不足之處，對亞硝酸鹽的檢測要根據(jù)不同精度的要求選取不同的檢驗(yàn)方法，不過最終的目的就是把亞硝酸鹽控制在安全范圍之內(nèi)，保證人民的生命安全。