延胡索生物堿的分離純化及抗炎作用研究

江明達,包文麗, 徐 寧,于佳琪,許 良

(內蒙古民族大學天然產物化學及功能分子合成自治區重點實驗室，內蒙古 通遼 028000)

蒙藥延胡索是罌粟科植物延胡索的塊莖，其味辛、苦、性溫、歸心、肝、脾經，具有活血化瘀、理氣止痛的功效[1]。目前從延胡索中分離40多種生物堿類化合物，可分為原小檗型、阿樸啡型、原阿片型、異喹啉芐咪唑啉型、異喹啉苯并菲啶型和雙芐基異喹啉型等生物堿[2-10]，同時還有甾體類、蒽醌類、有機酸類、糖類等化合物[11-14]。在現代藥理研究中，延胡索生物堿是消炎陣痛的主要生物活性化合物之一，其中延胡索乙素的鎮靜催眠作用最強，延胡索丑素次之，而延胡索奎素最差[15-16]。Leung等[17]通過高架迷宮(一種用于抗焦慮評估的行為模型)證實當給小鼠口服低劑量的延胡索乙素時，能夠較好的緩解小鼠的焦慮癥狀。延胡索能夠解除坐骨神經慢性壓迫性損傷所致神經病理性疼痛，其鎮痛程度甚至能夠達到典型鎮痛藥嗎啡作用的40%[18]。除此之外，延胡索具有抗腫瘤、抗潰瘍、抗肝損傷、抗心肌缺血等作用[20-26]。

分子對接技術是依據配體與受體作用的“鎖-鑰原理”，模擬配體小分子與受體生物大分子相互作用的一種技術方法。配體與受體相互作用是分子識別的過程，主要包括靜電作用、氫鍵作用、疏水作用、范德華作用等。通過計算，可以預測兩者間的結合模式和親和力發現配體-蛋白的相互作用方式，用于解釋生物學實驗、為發現活性化合物提供指導。分子對接作為一種虛擬篩選工具，特別適合從藥用植物中篩選出可呈藥性的先導化合物，從而降低實驗篩選化合物的數量，進而縮短研究周期。

本研究采用75%乙醇為溶劑，經石油醚、乙酸乙酯和正丁醇依次萃取，獲得乙酸乙酯部位，采用色譜技術分離純化延胡索中生物堿成分，并應用分子對接技術篩選生物活性化合物，為蒙藥延胡索的開發利用奠定基礎。

1 儀器與試劑

1.1 儀 器

FW100高速萬能粉碎機，天津市泰斯特儀器有限公司；RE-2002旋轉蒸發器，鄭州儀器設備有限公司；SHZ-CB循環水式多用真空栗，鞏義市子華儀器有限責任公司；KQ-250DE數控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；FA2104N電子分析天平，上海民橋精瓷科學儀器有限公司；DHG-9140鼓風干燥箱，上海賽歐試驗設備有限公司；B-220恒溫水浴鍋，上海亞榮生化儀器廠；JIDI-UP超純水機，廣州吉迪儀器有限公司；LC-6AD半制備高效液相色譜儀，日本島津有限公司；Bruker Avance 500 MHz核磁共振波譜儀，德國Bruker公司；ZF-8N智能暗箱式四用紫外分析儀，上海嘉鵬科技有限公司。

1.2 試 劑

無水乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、甲醇、二氯甲烷，分析純，天津大茂化學試劑廠；柱層硅膠、薄層硅膠、化學純，青島海洋化工有限公司。

2 實驗方法

2.1 延胡索化學成分的分離純化

稱取3.0 kg粉碎延胡索，用75%乙醇浸泡24.0 h，加熱回流提取后3.0 h，減壓濃縮回收乙醇獲得浸膏。將浸膏用石油醚層、乙酸乙酯和正丁醇依次進行萃取，再以甲醇-水為流動相經過反相C18柱將乙酸乙酯部位進行梯度洗脫，收集餾分Fr 1～Fr 5。

Fr 1采用硅膠柱層析分離，以二氯甲烷-甲醇體系(60:1、40:1、20:1、10:1、1:1)洗脫，獲得餾分Fr 1.1～10。Fr 1.3和Fr 1.7經過反復硅膠柱層析和硅膠薄層層析純化，獲得化合物1、2和3。

Fr 2采用硅膠柱層析分離，以二氯甲烷-甲醇體系(60:1、40:1、20:1、10:1、1:1)洗脫，獲得餾分Fr 2.1～18。Fr 2.2在室溫下析出固體，過濾，固體用二氯甲烷反復重結晶，獲得化合物4。濾液經硅膠柱層析分離，以二氯甲烷-甲醇體系(60:1、40:1、20:1、10:1、1:1)洗脫，獲得餾分Fr 2.2.1～Fr2.2.16。Fr 2.2.2經過反復硅膠柱層析和硅膠薄層層析純化，獲得化合物化合物5和6。Fr 2.2.4經過反復硅膠薄層層析純化，獲得化合物7和8。Fr 2.6采用硅膠柱層析分離，以二氯甲烷-甲醇體系(30:1)洗脫，經薄層層析檢測合并，再用半制備高效液相色譜純化，獲得化合物9和10。

Fr 3采用硅膠柱層析分離，以二氯甲烷-甲醇體系(60:1、40:1、20:1、10:1、1:1)洗脫，獲得餾分Fr 3.1～3.14。Fr3.2繼續用硅膠柱層析分離，以二氯甲烷-甲醇體系(80:1、70:1、60:1、50:1、40:1、30:1、20:1、10:1、1:1)洗脫，收集餾分Fr 3.2.1～3.2.7。Fr 3.2.1經反復硅膠薄層層析純化，獲得化合物11和12。

2.2 蛋白質靶點的篩選

根據生物信息學和多種數據庫中篩選出與抗炎相關的3個蛋白(COX-2、1S1R、1DVX)，下載蛋白的3D結構并保存。

2.3 分子對接Auto Dock

Auto Dock由Scripps 研究所的Olson實驗室開發與維護，運用拉馬克遺傳算法來計算配體與受體之間最佳的結合狀態。Auto Dock軟件由Auto Grid和Auto Dock兩個程序組成，還具備分子可視化輔助對接軟件 Auto Dock Tools程序。將下載的蛋白受體的3D結構以及蒙藥延胡索中分離出的12個化合物(四氫小蘗堿、巴馬汀、延胡索乙素、去氫紫堇堿、四氫紫堇薩眀、異紫堇球堿、四氫非洲防己胺、d-紫堇堿、四氫黃連堿、海罌粟堿、脫氫海罌粟堿、普魯托品)導入到對接軟件Auto Dock Tools中進行運算，得出對接自由能及一類構象數量。

3 結果與討論

3.1 化合物的鑒定

從蒙藥延胡索中分離出12個化合物，經1H NMR和13C NMR鑒定，它們分別為去氫紫堇(1)、延胡索乙素(2)、d-紫堇堿(3)、四氫小蘗堿(4)、四氫非洲防己胺(5)、四氫巴馬汀(6)、四氫黃連堿(7)、四氫紫堇薩眀(8)、異紫堇球堿(9)、海罌粟堿(10)、脫氫海罌粟堿(11)、普魯托品(12)，見圖1。

圖1 化合物1～12結構Fig.1 Strcture of compound 1～12

3.2 化合物1～12與蛋白COX-2作用

計算蒙藥延胡索中化合物與靶點蛋白的自由能以及一類構象數量來評估小分子的活性，其中接自由能反應了配體與蛋白之間的親和力結合能與對接的好壞成反比，自由能越低對接結果越穩定。一類構像數量是指最優構象相似的對接結果，數值越大，反應小分子在蛋白此位置結合的構象越多。

通過Auto Dock軟件計算12個生物堿化合物和蛋白COX-2的結合自由能，結果見表1和表2。從表中可以看出，延胡索中去氫紫堇、延胡索乙素、d-紫堇堿、四氫小蘗堿、四氫非洲防己胺、四氫巴馬汀、四氫黃連堿、四氫紫堇薩眀、異紫堇球堿、海罌粟堿、脫氫海罌粟堿、普魯托品與蛋白COX-2的最低結合自由能均低于-6.5，說明其與蛋白結合較好。其中普魯托品的最低自由能值最小，顯示出較強潛在的抗炎活性。

表1 化合物1～6與蛋白COX-2的結合自由能

表2 化合物7～12與蛋白COX-2的對接自由能

3.3 化合物1～12與蛋白1S1R作用

通過Auto Dock軟件計算12個生物堿化合物和蛋白1S1R的結合自由能，結果見表3和4。從表中可以看出，除四氫紫堇薩眀外，延胡索中去氫紫堇、延胡索乙素、d-紫堇堿、四氫小蘗堿、四氫非洲防己胺、四氫巴馬汀、四氫黃連堿、四氫紫堇薩眀、海罌粟堿、脫氫海罌粟堿、普魯托品與蛋白1S1R的最低結合自由能均低于-6.5，說明其與蛋白結合較好。其中四氫小蘗堿的最低自由能值最小，顯示出較強潛在的抗炎活性。

表3 化合物1～6與蛋白1S1R的結合自由能

表4 化合物7～12與抗炎蛋白1S1R的對接自由能

3.4 化合物1～12與蛋白1DVX作用

通過Auto Dock軟件計算12個生物堿化合物和蛋白1DVX的結合自由能，結果見表5和表6。從表5和表6中可以看出，延胡索中去氫紫堇、延胡索乙素、d-紫堇堿、四氫小蘗堿、四氫非洲防己胺、四氫巴馬汀、四氫黃連堿、四氫紫堇薩眀、異紫堇球堿、海罌粟堿、脫氫海罌粟堿、普魯托品與蛋白1DVX的最低結合自由能均低于-6.5，說明其與蛋白結合較好，但弱于蛋白COX-2和1S1R。其普魯托品的最低自由能值最小，顯示出較強潛在的抗炎活性。

表5 化合物1～6與蛋白1DVX的結合自由能

表6 化合物7～12 與抗炎蛋白1DVX的對接自由能

4 結 論

蒙藥延胡索是蒙醫常用藥材，具有消炎鎮痛作用。在分子對接研究中，延胡索含中生物堿原小檗堿型生物堿四氫小蘗堿、巴馬汀、延胡索乙素、去氫紫堇堿、異紫堇球堿、四氫非洲防己胺、d-紫堇堿、四氫黃連堿，阿樸啡型生物堿海罌粟堿、脫氫海罌粟堿，原阿片型生物堿普魯托品與抗炎蛋白COX-2、1S1R、1DVX均有較高的親和力，表明延胡索中生物堿可與多個靶點蛋白結合，具有潛在的抗炎生物活性，但仍需要通過體內活性實驗驗證。