基于TCGA數據庫和蛋白-蛋白對接分析DMGDH在腎透明細胞癌組織中的表達及臨床意義

韓 君 張澤鑫

(1. 北京康仁堂藥業有限公司，北京 101301； 2. 廣州中醫藥大學第一臨床醫學院，廣東 廣州 510405)

腎細胞癌最常見的亞型是透明細胞癌，約占腎細胞癌的70%～80%[1-3]。腎透明細胞癌(KIRC)通常對放化療和免疫治療不敏感，主要治療方法是手術治療[4]。60%的KIRC患者在診斷后1～2年死亡，30%的KIRC患者在診斷時就發生了遠處轉移[5，6]。自精準醫療計劃提出以來，個體化治療成為腎癌治療的研究熱點[7，8]。因此，尋找有效的治療靶點及預后的分子標志物，對于幫助早期診斷腎透明細胞癌以及早期干預治療提供依據。二甲基甘氨酸脫氫酶(DMGDH) 是一種線粒體基質黃素蛋白，負責二甲基甘氨酸的去甲基化，形成肌氨酸[9]。據報道，DMGDH在肝癌病人中顯著下調，其通過影響Akt信號通路的活化，從而促進肝癌細胞的轉移[10，11]。前期研究白扁豆總皂苷處理前列腺癌PC-3細胞系時，DMGDH的水平顯著升高，提示DMGDH可能與腫瘤發生和發展密切相關。目前，DMGDH與KIRC患者的表達、生存時間及預后的分析鮮見報告。在此，本研究利用癌癥基因組圖譜(TCGA)數據庫中KIRC患者的信息，分析DMGDH與臨床病理特征、預后的相關性，并選擇幾條可能的信號通路進行進一步研究，為今后的臨床治療提供幫助。

1 資料與方法

1.1 DMGDH在泛癌中的表達分析

從UCSC(https://xenabrowser.net/)數據庫中下載了經統一標準化的泛癌數據集：TCGA泛癌(Pan-Cancer) (PANCAN,N=10 535,G=60 499)，進一步從中提取了ENSG00000132837(DMGDH)基因在各個樣本中的表達數據，進一步篩選了樣本來源為正常實體組織(Solid Tissue Normal)、血液相關癌(Primary Blood Derived Cancer-Peripheral Blood)、原發性腫瘤(Primary Tumor)的樣本。更進一步地對每一個表達值進行了log2(x+0.001)變換，最后剔除了單個癌種中樣本個數小于3個的癌種，最終獲得了26個癌種的表達數據。

1.2 DMGDH在泛癌中的生存分析

從UCSC(https://xenabrowser.net/)數據庫中下載了經統一標準化的泛癌數據集：TCGA Pan-Cancer (PANCAN,N=10 535,G=60 499)，進一步從中提取了ENSG00000132837(DMGDH)基因在各個樣本中的表達數據，進一步篩選了樣本來源為：Primary Blood Derived Cancer-Peripheral BloodTCGA-急性髓性白血病(LAML)、Primary Tumor和TCGA-皮膚黑色素瘤(SKCM)的轉移樣本，此外，還從先前發表在Cell上的TCGA預后研究中[12]獲得了高質量的TCGA的預后數據集及隨訪時間短于30天的樣本，更進一步的對每一個表達值進行了log2(x+0.001)變換，最后還剔除了單個癌種中樣本個數小于10個的癌種，最終獲得了39個癌種(TCGA-GBM神經膠質瘤、TCGA-GBMLGG膠質瘤、TCGA-LGG腦低級別膠質瘤、TCGA-CESC宮頸鱗癌和腺癌、TCGA-LUAD肺腺癌、TCGA-LAML急性髓細胞樣白血病、TCGA-BRCA乳腺浸潤癌、TCGA-ESCA食管癌、TCGA-STES胃和食管癌、TCGA-SARC肉瘤、TCGA-KIRP腎乳頭狀細胞癌、TCGA-KIPAN混合腎癌、TCGA-PRAD前列腺癌、TCGA-STAD胃癌、TCGA-HNSC頭頸鱗狀細胞癌、TCGA-KIRC腎透明細胞癌、TCGA-COAD結腸癌、TCGA-COADREAD結直腸癌、TCGA-LUSC肺鱗癌、TCGA-THYM胸腺癌、TCGA-LIHC肝細胞肝癌、TCGA-THCA甲狀腺癌、TCGA-MESO間皮瘤、TCGA-READ直腸腺癌、TCGA-SKCM-M、TCGA-SKCM皮膚黑色素瘤、TCGA-OV卵巢漿液性囊腺癌、TCGA-TGCT睪丸癌、TCGA-PAAD胰腺癌、TCGA-UCEC子宮內膜癌、TCGA-PCPG嗜鉻細胞瘤和副神經節瘤、TCGA-SKCM-P、TCGA-UVM葡萄膜黑色素瘤、TCGA-UCS子宮肉瘤、TCGA-BLCA膀胱尿路上皮癌、TCGA-ACC腎上腺皮質癌、TCGA-KICH腎嫌色細胞癌、TCGA-CHOL膽管癌、TCGA-DLBC彌漫性大B細胞淋巴瘤)的表達數據及對應樣本的總生存期數據。

1.3 DMGDH單基因預后模型構建

首先根據DMGDH表達量的百分位數(50%)將患者分成兩組，然后進一步使用R軟件包生存分析的survfit函數分析兩組的預后差異，利用時序檢驗(log-rank test)方法評估不同組樣本之間的預后差異顯著性。此外，還使用了受試者工作特征曲線(ROC)計算曲線下面積(AUC)用于評估DMGDH在1、3、5年的模型穩定性。

1.4 DMGDH列線圖構建

根據DMGDH表達量、年齡、性別和TNM分期，首先使用單因素cox分析篩選出預后相關因素，然后進一步使用多因素cox分析篩選出獨立的預后因素。在單因素cox分析和多因素cox分析中，具有顯著性水平的因素將被納入到列線圖的構建中，用以評估患者的預后。

1.5 基于DMGDH差異表達的GO和KEGG功能富集分析

根據DMGDH的表達量，截取了中位數進行差異分析，設置標準為：Log∣FC∣>1，P<0.05。然后對差異表達的基因進行了基因功能注釋(GO)和基因組京都百科全書(KEGG)功能富集分析，以了解DMGDH在KIRC的發生發展中發揮的作用。

1.6 蛋白-蛋白對接

從uniprot(https://www.uniprot.org/)數據庫查詢蛋白序列及晶體結構信息，然后從RCSB PDB (https://www.rcsb.org/)數據庫獲取蛋白晶體結構：DMGDH：3E00，PPAR γ：5L46，PPAR α：1K7L，CYP1B1:3PM0。所有對接計算均采用Rosetta蛋白-蛋白對接方法。首先使用ROSETTA蛋白準備模塊docking_prepack_protocol.static.linuxgccrelease預處理四個蛋白結構，并作為蛋白對接初始結構。對接過程中蛋白質主鏈保持固定，采用global算法(docking_protocol.static.linuxgccrelease)進行蛋白-蛋白對接。每個起點總共生成50個結構。視覺檢查五個界面得分最低的結果，并使用pymol分析對接結果。

2 結果

2.1 DMGDH在泛癌中的表達分析

使用R軟件(version 3.6.4)計算了每個腫瘤中正常樣本和腫瘤樣本的表達差異(圖1A)，使用非配對的進行非參數檢驗和符號秩檢驗進行差異顯著性分析，在1種腫瘤中觀察到了顯著上調，在19種腫瘤中觀察到了顯著下調。

2.2 DMGDH在泛癌中的生存分析

使用R軟件包survival(version 3.2-7)的coxph函數建立Cox風險比例回歸模型(Cox proportional hazards regression model)[13]以分析基因表達與每個腫瘤中的預后關系，使用Log-rank test進行統計檢驗獲得預后顯著性，最終觀察到在2個腫瘤類型TCGA-STAD[N=372,p=0.04,HR=1.14(1.01,1.29)]、TCGA-COADREAD[N=368,p=0.04,HR=1.19(1.01,1.40)]中高表達預后差，在4個腫瘤類型TCGA-KIPAN[N=855,p=0.02,HR=0.92(0.86,0.99)]、TCGA-KIRC[N=515,p=2.5e-11,HR=0.78(0.72,0.84)]、TCGA-LIHC[N=341,p=1.6e-3,HR=0.87(0.79,0.95)]、TCGA-ACC[N=77,p=0.04,HR=0.81(0.66,0.99)]中低表達預后差(圖1B)。

2.3 DMGDH單基因預后模型構建

根據DMGDH基因表達的中位數，劃分成為了高低兩組。根據患者的風險值和分組，繪制風險值熱圖(圖1C)，Kaplan-Meier生存分析顯示，高低風險組之間具有顯著性差異，其P值為3.92e-07，HR值為0.443(圖1D)，這說明了DMGDH在KIRC中是預后的保護因素。風險曲線顯示，隨著風險系數的增高，存活的病人越多，這與Kaplan-Meier生存分析抑制。此外，ROC曲線計算AUC面積評估了模型的可靠性，分別為1年0.688，3年0.675，5年0.659，這說明了使用DMGDH用于評估患者的總體生存情況具有可靠性(圖1E)。

(A) DMGDH基因在不同癌癥和癌旁組織中表達水平;(B) DMGDH在泛癌中的生存分析；(C) 風險值熱圖;(D) Kaplan-Meier生存曲線圖用于評估患者的預后;(E) 時間依賴的ROC曲線評估風險特征的準確性圖1 DMGDH基因在泛癌中的表達與生存分析及預后模型構建(A) Expression levels of DMGDH gene in different cancers and paracancerous tissues； (B) Survival analysis of DMGDH in pan-cancer； (C) Value-at-risk heat map； (D) Kaplan-Meier survival curve chart for assessing patient’s prognosis； (E) Accuracy of time-dependent ROC curves for assessing risk characteristicsFig. 1 Expression of DMGDH gene in pan-cancer and survival analysis and prognostic model construction

2.4 DMGDH列線圖構建

根據DMGDH表達量、年齡、性別和TNM分期，首先使用了單因素cox分析篩選出預后相關的因素。單因素cox分析結果顯示，DMGDH、年齡和TNM分期是預后相關的因素(圖2A)。多因素結果顯示DMGDH、年齡和TNM分期是獨立的預后因素(圖2B)，因此構建列線圖，其生存模型C指數(C-Index)為0.776(0.742～0.81) (圖2C)，其1、3、5年的校正曲線位于對角線復線，說明了本模型具有可靠性(圖2D)。

2.5 基于DMGDH差異表達的GO和KEGG功能富集分析

根據DMGDH的表達量，截取了中位數進行差異分析，設置標準為：Log∣FC∣>1，P<0.05。然后對差異表達的基因進行了GO和KEGG功能富集分析，以了解DMGDH在KIRC的發生發展中發揮的作用。GO分析結果顯示，DMGDH可能通過羧酸轉運發揮作用(圖3A)；KEGG分析結果顯示，DMGDH可能通過藥物代謝-細胞色素P450發揮作用(圖3B)。

2.6 蛋白-蛋白對接

三對蛋白對接分數：PPAR γ/DMGDH為-1 209.853 kcal/mol；PPAR α/DMGDH為-1 086.638 kcal/mol；CYP1B1/DMGDH為-798.415 kcal/mol。PPAR γ/DMGDH相互作用分析氫鍵Gln273和Lys180， His466和Asn179，Gln294和Glu171，Glu298和Lys85(圖3C)，PPAR α/DMGDH相互作用分析氫鍵lys399和Asp652，Asn303和Asn566，Asn577，Glu462和Lys764，Gln461和Ala765(圖3D)，CYP1B1/DMGDH相互作用分析氫鍵 Asn312和Gln68；Asp310和Gln68，Arg76(圖3E)。

(A) 單因素cox分析篩選出了預后相關因素;(B) 多因素cox分析篩選出了預后相關因素;(C) 生存列線圖預測模型;(D) 預測肝細胞癌患者第1、3、5年生存期的校正曲線圖2 構建列線圖用以評估患者的總體生存情況(A) Screening out prognostic correlates with one-way cox analysis； (B) screening out prognostic correlates multi-factor cox analysis； (C) Survival nomogram prediction model； (D) Calibration curves for predicting survivals of patients with hepatocellular carcinoma at the 1st, 3rd, 5th yearFig. 2 Construction of nomogram to assess overall survival conditions of patients

3 討論

本研究對TCGA的39種腫瘤的相關臨床信息數據進行了系統分析，發現DMGDH在TCGA-STAD、TCGA-COADREAD中高表達預后差，在4個腫瘤類型TCGA-KIPAN、TCGA-KIRC、TCGA-LIHC、TCGA-ACC中低表達預后差。DMGDH單基因預后模型構建，說明了DMGDH在KIRC中是預后的保護因素。構建的生存列線圖多因素結果顯示DMGDH、年齡和TNM分期是獨立的預后因素，提示與其它腫瘤類型相比，DMGDH可能在KIRC的發生、發展中發揮了重要的作用。

DMGDH如何參與KIRC的發生、發展目前仍知之甚少。為了進一步探究DMGDH在KIRC中的生物學功能，根據DMGDH的表達量，對差異表達的基因進行了GO和KEGG功能富集分析。結果顯示，主要富集過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)信號通路和細胞色素P450代謝等有關，這結果與文獻一致，Xu Y等[14]詳細分析KIRC中整個 PPAR通路并成功建立患者預后風險模型的研究，過氧化物酶體增殖物激活受體(PPARs)屬于核激素受體超家族成員，包括過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)、過氧化物酶體增殖物激活受體α(PPARα)和過氧化物酶體增殖物激活受體β/δ(PPARβ/δ)3個亞型[15]，PPARα等核受體是KIRC獨立的預后因素[16]可作為KIRC的臨床診斷和預后生物標志物[17]。具有晶型結構細胞色素P450(CYP450)亞型的受體蛋白為細胞色素P450家族1亞家族A成員2(CYP1A2)、細胞色素P450家族2亞家族C成員19(CYP2C19)、細胞色素P450家族1亞家族A成員1(CYP1A1)、細胞色素P450家族1亞家族B成員1(CYP1B1)、細胞色素P450家族2亞家族E成員2(CYP2E2)[18]，CYP1B1是一種細胞色素P450酶，在多種惡性腫瘤中過度表達[19]，CYP1B1的多態性與腎癌發生相關[20]。本研究利用DMGDH分別與PPARγ、 PPARα和CYP1B1三種蛋白進行蛋白-蛋白對接，結果兩者之間結合較好分別為-1 209.853 kcal/mol、-1 086.638 kcal/mol和-798.415 kcal/mol。

綜上所述，本研究明確了DMGDH在多種腫瘤中的表達情況，其在KIRC中是預后的保護因素，DMGDH可能通過PPAR信號通路和P450代謝來影響肝癌的發生、發展。

(A) DMGDH差異表達GO富集分析；(B) DMGDH差異表達KEGG富集分析；(C) PPAR gamma/DMGDH對接；(D) PPAR alpha/DMGDH對接；(E) CYP1B1/DMGDH對接圖3 DMGDH差異表達的GO和KEGG富集分析及蛋白-蛋白對接(A) GO enrichment analysis of DMGDH differential expression； (B) KEGG enrichment analysis of DMGDH differential expression； (C) PPAR gamma/DMGDH docking； (D) PPAR alpha/DMGDH docking； (E) CYP1B1/DMGDH dockingFig. 3 GO and KEGG enrichment analysis and protein-protein docking of DMGDH differential expression