米替福新對耐氟康唑白念珠菌耐藥性的體外逆轉作用 及機制

吳永琴， 應春妹

隨著臨床器官移植和惡性腫瘤患者的增加、廣譜抗生素的濫用和免疫抑制劑的廣泛使用，真菌感染特別是念珠菌感染發生率和死亡率不斷上升[1]，死亡率接近50%[2]。侵襲性念珠菌感染對于臨床治療仍是一個棘手問題。氟康唑等唑類藥物是臨床上應用最廣泛的抗真菌藥物，但是目前臨床分離的念珠菌對唑類藥物已經出現了不同程度的耐藥[3]。

米替福新（miltefosine）是一種用于治療由利什曼蟲引起疾病的口服藥物[4]，而且并未發生嚴重不良事件[5-6]。前期研究顯示米替福新單藥具有良好的抗真菌效果[7-8]。本次研究測試了米替福新和氟康唑對臨床分離耐氟康唑白念珠菌的協同作用，探索米替福新降低耐氟康唑白念珠菌耐藥性的內在機制，現將結果報道如下，以期為臨床抗真菌治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料來源

1.1.1 實驗菌株 收集25株氟康唑耐藥白念珠菌和8株氟康唑敏感白念珠菌，均為復旦大學附屬婦產科醫院檢驗科凍存菌株，33株菌株分離自真菌陰道炎患者陰道分泌物或其他患者無菌部位標本。所有白念珠菌均通過MALDI-TOF質譜分析儀鑒定到種，保存于25%甘油酵母浸出粉胨葡萄糖培養基（YPD）保存液中，-80℃冷凍保存。實驗前取少許凍存菌液涂布于YPD平板上，于30℃培養2 d，傳代2次后用于后續實驗。

1.1.2 抗真菌藥物與主要試劑 氟康唑購自Selleck公司（批號：S1331），米替福新購自Sigma-Aldrich公司（批號：M5571）。RPMI 1640培養基和MOPS購自Sigma-Aldrich公司，用于配置YPD培養基的蛋白胨等均購自上海生工生物工程股份有限公司。RNA反轉錄試劑盒和實時熒光定量PCR試劑盒均購自TaKaRa公司。羅丹明6G購自Sigma-Aldrich公司（批號：252433）。ATP發光檢測試劑盒購自北京威格拉斯生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 抗真菌藥敏試驗 參照美國CLSI M27-S4文件采用肉湯微量稀釋法測定氟康唑和米替福新對白念珠菌的MIC。氟康唑使用DMSO溶解，米替福新使用雙蒸水溶解。藥物經RPMI 1640培養液倍比稀釋后，氟康唑的工作濃度為0.25～128 mg/L，米替福新的工作濃度為0.015～8 mg/L。氟康唑MIC為與生長對照孔相比，生長50%及以上受抑制所對應的最低藥物濃度，而米替福新MIC定義為與生長對照孔相比，生長100%受抑制所對應的最低藥物濃度。試驗質控菌株為近平滑念珠菌ATCC 22019和克柔念珠菌ATCC 6258。氟康唑藥敏結果按照CLSI M60文件判斷。

采用棋盤式肉湯微量稀釋法檢測米替福新和氟康唑聯用的抑菌效果。氟康唑用DMSO溶解并通過倍比稀釋制備成濃度范圍為25～25 600 mg/L的藥液，米替福新制備成濃度范圍為50～3 200 mg/L的藥液；然后用RPMI 1640培養液50倍稀釋制備成工作液，最后于96孔板中2～12列按濃度梯度加入50 μL氟康唑藥液，并且于B～H行按濃度梯度加入50 μL米替福新藥液，制備成聯合藥敏板。挑取平板上各菌株的菌落制備菌懸液，并調整其濃度至0.5麥氏濁度，然后使用RPMI 1640培養基依次進行50倍和20倍稀釋。于配制好的聯合藥敏板中加入100 μL制備好的菌懸液，于37℃孵箱中培養24 h后觀察結果。至此，受試菌株菌懸液終濃度在（0.5～2.5）×103CFU/mL，氟康唑測試終濃度范圍為0.125～128 mg/L，而米替福新終濃度范圍為0.25～16 mg/L。氟康唑和米替福新體外相互作用方式以部分抑菌濃度指數（FICI）判定：FICI≤0.5，表明兩者具有協同抑菌作用； 0.5＜FICI≤4.0，表明兩者無相互作用；FICI＞4.0，表明兩者具有拮抗作用[9]。

1.2.2 實時熒光定量PCR試驗 取100 μL過夜培養白念珠菌菌液，于10 mL YPD培養基中培養4～6 h至生長對數期。取2 mL菌液應用酵母總RNA快速抽提試劑盒（上海生工生物工程有限公司）進行抽提白念珠菌總RNA。使用超微量核酸蛋白濃度測定儀初步檢測提取的總RNA濃度，并取500 ng左右的總RNA，應用反轉錄試劑盒將其反轉錄為cDNA，然后通過實時熒光PCR試劑盒檢測CDR1、CDR2和內參ACT1基因的mRNA表達水平。CDR1和CDR2基因的mRNA相對表達水平使用2?ΔΔCt策略[10]。計算對照組所有菌株目的基因與內參基因ACT1校正后表達水平的平均值，各實驗組菌株mRNA表達水平即為與該平均值比較后的相對表達水平。所用引物見表1。

表1 熒光定量PCR所用引物Table 1 Primers used in fluorescence quantitative polymerase chain reaction

1.2.3 羅丹明6G外排實驗 挑取單個菌落接種于YPD培養基中，于30℃培養箱振蕩培養過夜，取200 μL過夜菌液于5 mL YPD培養基中，分成米替福新處理組和無藥對照組，分別加入終濃度為 2 mg/L的米替福新和等體積的PBS，繼續振蕩孵育6 h后離心收集真菌細胞，用PBS洗滌后調整細胞數至1×108/mL。對照組和米替福新處理組各取1 mL重懸菌液加入終濃度為10 μmol/L的羅丹明6G，振蕩孵育2 h，使用熒光讀板儀讀取真菌外排到上清液中的羅丹明6G熒光強度，并統計分析米替福新對耐藥菌株外排泵功能的影響。

1.2.4 ATP含量檢測 菌株培養液離心棄上清液后用PBS重懸制備成2.0麥氏濁度的菌懸液，依次進行稀釋，應用改良牛鮑氏計數板對稀釋后菌懸液中的孢子數量進行計數，通過計算最終獲取107/mL的菌懸液。取1 mL該菌懸液，應用ADP/ATP發光檢測試劑盒按試劑盒說明書檢測真菌孢子胞內總ATP相對含量的變化。

1.2.5 統計學分析 采用GraphPad Prism 5.0軟件進行作圖和統計學分析，多組間比較采用方差分析，兩組樣本間比較采用t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 米替福新和氟康唑聯合使用的抗真菌效果

米替福新和氟康唑聯合使用對臨床分離白念珠菌的抗菌結果表明，米替福新單獨使用時，對氟康唑耐藥（MIC為16～128 mg/L）的白念珠菌就有顯著效果，MIC為1～4 mg/L；通過計算FICI數值發現，米替福新和氟康唑聯用對11株（44%）耐氟康唑白念珠菌臨床分離株具有協同抗真菌效果（FICI≤0.5），而在大部分無協同作用的臨床分離株中，1 mg/L米替福新可以使氟康唑的MIC值降至1/8，甚至是1/16。此外，1 mg/L米替福新+8 mg/L氟康唑對大部分臨床分離耐氟康唑白念珠菌具有很好的抗真菌效果。見表2。

表2 米替福新和氟康唑聯合抗白念珠菌藥敏結果Table 2 Antifungal synergy testing of fluconazole-miltefosine combination against Candida albicans

2.2 白念珠菌CDR1和CDR2基因表達水平檢測

為探究米替福新和氟康唑協同抑菌作用機制，根據有無協同作用將耐氟康唑白念珠菌分為協同作用組和無作用組，同時取臨床分離氟康唑敏感菌株外排泵基因表達為對照組。通過實時熒光定量PCR實驗發現，協同作用組相對于無作用組CDR1和CDR2基因表達水平顯著上調，差異具有統計學意義（P＜0.01）；而無作用組與對照組菌株CDR1和CDR2基因mRNA表達無明顯差異，見圖1。這表明，米替福新可能是通過影響白念珠菌外排泵功能來協同氟康唑發揮抗菌作用。

2.3 米替福新對CDR1和CDR2基因mRNA表達的影響

選取3株高表達CDR1和CDR2基因的臨床分離株，使用2 mg/L米替福新處理白念珠菌后發現，米替福新處理組CDR1和CDR2基因的mRNA表達與對照組（未用米替福新處理）相比未見明顯差異，表明不影響基因表達。見圖2。

2.4 米替福新對白念珠菌外排泵活性和胞內ATP水平的影響

采用羅丹明6 G外排實驗測定白念珠菌外排泵活性，用米替福新作用的3株白念珠菌對羅丹明的外排能力與對照組相比顯著下降，差異具有統計學意義，見圖3A。白念珠菌ABC外排泵是ATP依賴性的，因此米替福新可能影響了白念珠菌胞內ATP水平。經檢測選取的3株臨床菌株胞內ATP總水平時發現，米替福新作用后的白念珠菌胞內總ATP水平顯著下降，見圖3B。因此，米替福新可能是通過影響真菌胞內能量ATP的供應來抑制白念珠菌外排泵活性，從而達到降低耐藥白念珠菌的耐藥性。

3 討論

文獻報道米替福新具有很好的抗酵母樣真菌和絲狀真菌效果[7,11]，但米替福新聯合氟康唑發揮協同抗菌效果及其機制未見報道。本研究發現，對于高表達CDR1和CDR2基因的臨床分離耐藥白念珠菌，米替福新可以逆轉其對氟康唑的耐藥性，可能機制是米替福新通過影響菌株能量ATP的供應來抑制其對氟康唑的外排。這提示“老藥”米替福新可以發展成為一種外排泵抑制劑，從而輔助臨床抗耐藥念珠菌的治療。

外排泵活性增強是白念珠菌對唑類藥物耐受的主要機制之一，即通過將唑類藥物外排到胞外來降低胞內藥物濃度從而介導耐藥[12]。介導耐藥的外排泵根據外排機制和能量來源不同主要分為兩類跨膜轉運蛋白：含ATP結合盒結構的轉運蛋白超家族(ABC transporters)和主要易化載體超家族[13]。白念珠菌外排泵蛋白相關編碼基因CDR屬于ABC轉運蛋白超家族，有CDR1～CDR10共10個基因，但其中只有CDR1和CDR2基因高表達與唑類藥物的耐藥有關，CDR1和CDR2基因的高表達導致外排泵將更多的藥物排出胞外，從而導致白念珠菌對唑類藥物耐藥[14]。而外排泵基因CDR1和CDR2高表達的臨床菌株占臨床分離的唑類耐藥白念珠菌中的大多數[15]。

應用外排泵抑制劑是解決真菌耐藥問題的一個重要思路，也是目前的研究熱點。據報道，鈣離子拮抗劑維拉帕米能夠抑制白念珠菌外排泵活性，而且在體內外均能與氟康唑發揮協同作用[16]。此外，苯乙烯基喹啉也具有白念珠菌外排泵抑制劑活性[17]，因此有研究學者提出唑類藥物聯合真菌外排泵抑制劑的治療方式應該成為一種重要的抗真菌策略[18]。本研究表明米替福新是一種外排泵抑制劑，而且米替福新是臨床已經應用于寄生蟲病治療的藥物，這使得米替福新更容易開發為臨床抗真菌藥物的聯合藥物。

念珠菌外排泵ABC轉運蛋白發揮活性是依賴于ATP的，糖酵解過程產生的ATP是白念珠菌能量獲取的重要方式[19]。據報道木質素化合物SWL-1就是通過抑制白念珠菌糖酵解途徑，進而阻斷菌株ATP的供應，從而逆轉耐藥白念珠菌的耐藥性[20]。與該化合物作用類似，本研究發現米替福新能夠降低白念珠菌胞內ATP水平，這可能是米替福新抑制白念珠菌外排泵活性的直接原因。然而，米替福新降低白念珠菌胞內ATP水平的分子機制有待后續的深入研究。

綜上顯示，米替福新能夠顯著降低高表達外排泵基因的耐藥白念珠菌對氟康唑的耐藥性，其主要機制可能是米替福新通過降低ATP的供應來抑制白念珠菌的外排泵活性。本研究將對促進“老藥”米替福新開發為臨床抗真菌藥物具有重要意義，也為解決臨床真菌耐藥問題提供新策略。