肺炎克雷伯菌逃避中性粒細胞免疫的機制

王蕾蕾， 王明貴， 楊 帆

肺炎克雷伯菌是臨床分離常見的革蘭陰性桿菌[1]，可引起肺炎、血流感染、肝膿腫和眼內炎等多種疾病。根據毒力和致病特點，肺炎克雷伯菌可分為普通肺炎克雷伯菌（cKP）和高毒力肺炎克雷伯菌（hvKP）[2]。

固有免疫是生物在長期進化過程中逐漸形成的，是機體防御病原微生物入侵的第一道防線，其中中性粒細胞在免疫防御中至關重要。感染初期，中性粒細胞從外周血被迅速趨化募集至感染部位，進而通過吞噬、中性粒細胞胞外誘捕網（NET）、脫顆粒和活性氧（ROS）等方式發揮直接抗病原微生物感染作用。中性粒細胞還能與其他免疫細胞（巨噬細胞和樹突狀細胞等）協同清除病原體[3]。

肺炎克雷伯菌能通過多種途徑逃避機體中性粒細胞的防御作用，本文就此作一綜述，以期更好地理解肺炎克雷伯菌感染。

1 抗吞噬并抑制ROS生成

中性粒細胞可伸出偽足對病原體進行抓捕并吞噬，細胞膜內陷包裹病原體形成吞噬小體，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶復合體組合、活化并嵌入吞噬小體的脂質雙分子層，通過呼吸爆發產生大量的ROS殺傷病原體[4]。此外，中性粒細胞存在各級顆粒，包括初級顆粒（也稱嗜天青顆粒）、次級顆粒（也稱特異性顆粒）、三級顆粒和分泌囊泡[5]。這些顆粒可向吞噬小體內分泌髓過氧化物酶（MPO）和彈性蛋白酶（NE）等抗菌物質，進一步增強對病原體的殺傷。

肺炎克雷伯菌的莢膜多糖和脂多糖（LPS）可抵抗中性粒細胞的吞噬和殺傷作用[5]。Wang等[6]通過透射電鏡觀察到hvKP被中性粒細胞吞噬后，菌體細胞壁完整，并且可見細菌分裂、繁殖現象，而cKP菌體細胞壁不完整且菌體開始裂解。Pan等[7]敲除了高毒力肺炎克雷伯菌NTUH-K2044的蛋白酶ClpX和LPS的O抗原轉運體Wzm后，發現敲除株的莢膜減少，使得人中性粒細胞對其吞噬率明顯高于野生株。

果糖-1,6-二磷酸醛縮酶（FBA）也能作為與中性粒細胞的交互因子，有助于肺炎克雷伯菌抗中性粒細胞吞噬，但具體機制有待進一步研究[8]。FBA分布于K1血清型肺炎克雷伯菌的細胞質和外膜中，是糖酵解和糖異生途徑的中心酶[8]。

肺炎克雷伯菌的莢膜多糖還抑制中性粒細胞生成ROS[9]。ST258型肺炎克雷伯菌細胞壁組分LPS的脂質A組分通過Toll樣受體4（TLR4）傳遞信號，使之被中性粒細胞識別，而多糖組分可能通過另一種受體傳遞負性信號來抑制ROS[10]。

2 抑制NET生成

NET是由中性粒細胞形成并釋放到胞外的纖維網狀結構，包括DNA、組蛋白、MPO、NE、抗菌肽和鈣顆粒蛋白等[11]。NET能捕獲病原體，限制病原體的擴散；NET內抗菌物質富集，有利于降解毒力因子，也有助于清除病原體。佛波酯（PMA）、LPS、鈣離子載體以及細菌、病毒和寄生蟲等微生物均可誘導NET形成。NET的形成過程稱為NETosis，這不同于細胞壞死和凋亡，是一種新型的細胞程序性死亡方式。

目前認為NETosis可通過以下3 種模式發 生[12]：①依賴NADPH的NETosis。當中性粒細胞被刺激后，細胞外信號調節激酶（ERK）級聯反應被激活，NADPH氧化酶活化并產生ROS。ROS促進中性粒細胞顆粒解體，使NE和MPO進入細胞質。NE和MPO隨后進入細胞核，剪切組蛋白，繼而染色質解聚，核膜破裂，DNA、組蛋白和蛋白酶等進入細胞質，共同組成NET。隨后，胞膜破裂，NET釋放至胞外[13]。②不依賴NADPH、依賴鈣的NETosis。當細胞內鈣離子增加，肽基精氨酸脫氨酶4（PAD4）與鈣離子結合，進入細胞核，使組蛋白H3和H4上帶正電荷的精氨酸殘基轉化為瓜氨酸。正電荷減弱使組蛋白從負電荷的DNA上解離，導致核小體解凝[14-15]。③NET的快速形成過程。在細菌所致感染中，NET能快速形成[13]。

Birnberg-Weiss等[5]發現，ST258型肺炎克雷伯菌干擾中性粒細胞釋放初級顆粒，并抑制其生成NET，從而推測，這可能由于肺炎克雷伯菌抑制鳥苷三磷酸酶（GTPase）（如Rac2）活化，或結合中性粒細胞表面抑制性受體來干擾其脫顆粒。Wang等[6]則通過掃描電鏡觀察到血清型為K1型的高毒力肺炎克雷伯菌（hvKP-K1）和cKP均能誘導NET的釋放，但NET中hvKP-K1數量少，且hvKP-K1菌體表面未出現代表凋亡或死亡的“小孔”，這提示hvKP對NET的誘捕和清除具有抗性。

3 干擾中性粒細胞凋亡和胞葬

肺炎克雷伯菌干擾中性粒細胞凋亡及胞葬。胞葬作用（efferocytosis）是指在磷脂轉位酶（如翻轉酶）協助下，凋亡細胞增加胞膜外側的磷脂酰絲氨酸（PS），該“eat me”信號被吞噬細胞（巨噬細胞等）表面受體識別，進而使凋亡細胞被吞噬和清除。胞葬作用主要針對死亡或垂死的細胞，能終止炎癥和感染。

Lee等[9]從肝膿腫患者體內分離出血清型為K1型的肺炎克雷伯菌即KP-M1，并將其突變為無莢膜株KP-DT-X，將兩者均感染人中性粒細胞后，發現感染KP-M1的中性粒細胞可存活至感染后 24 h，而未感染和感染KP-DT-X的中性粒細胞在10 h內發生凋亡。因此，肺炎克雷伯菌的莢膜參與干擾中性粒細胞凋亡。此外，KP-M1通過下調Bax與Bcl-2、Mcl-1的比值來延遲中性粒細胞中含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（caspase） -3的激活，誘導抗凋亡細胞因子白細胞介素（IL） -8，從而對中性粒細胞發揮抗凋亡作用[9]。也有研究發現，hvKP可通過上調p65蛋白表達，抑制NF-κB信號轉導途徑，導致中性粒細胞凋亡延遲[16]。

當肺炎克雷伯菌感染中性粒細胞時，維持生物膜磷脂不對稱性分布的中性粒細胞磷脂翻轉酶活性增強，通過水解ATP將PS從生物膜胞外側轉運至胞漿側，中性粒細胞表面的凋亡信號PS減少，促凋亡caspase-3和caspase-7、caspase-8下調，正常凋亡途徑受到抑制，同時巨噬細胞無法識別胞葬信號而無法有效吞噬該中性粒細胞。此外，壞死性凋亡相關的受體相互作用蛋白激酶RIPK1上調，RIPK3磷酸化，混合系蛋白激酶樣結構域蛋白MLKL磷酸化后轉位到質膜，壞死性凋亡程序被激活，從而導致中性粒細胞增多和炎癥持續[17]。

此時被感染的中性粒細胞可能被肺炎克雷伯菌用作“特洛伊木馬”，胞內的肺炎克雷伯菌隨其遷移至宿主其他部位，導致感染的播散和轉移，從而發展為一種獨特的侵入性綜合癥[18]。

中性粒細胞是機體抵御外來病原體感染的重要免疫細胞，其防御機制較為多樣。肺炎克雷伯菌也相應發展出一系列免疫逃避機制，但其深入機制仍有待研究。