液相色譜串聯質譜法測定人血漿中多黏菌素E1、E2濃度

黃曉嵐， 劉笑芬， 王 雨， 范亞新， 毋海蘭， 郭蓓寧， 張 菁

多黏菌素是擬芽孢桿菌屬通過非核糖體酶合成的一種多肽類抗菌藥物，20世紀50年代開始應用于臨床，由于其明顯的腎毒性和神經毒性于20世紀70年代被禁用[1-2]。該藥主要通過與革蘭陰性菌細胞膜脂多糖中帶負電荷的磷酸基結合，改變細胞膜通透性而發揮抗菌作用[3]。由于耐藥菌檢出逐年增加，以及缺乏新型有效的抗菌藥物，多黏菌素成為臨床治療廣泛耐藥革蘭陰性桿菌（如肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌及鮑曼不動桿菌）的重要藥物之一[4]。

目前，已上市的多黏菌素類藥物包括硫酸多黏菌素B、多黏菌素E甲磺酸鹽（CMS）及硫酸多黏菌素E。CMS是前藥，須在體內經水解轉化為多黏菌素E才具有抗菌活性，但轉化后的多黏菌素E在體內濃度較低。為此，上海上藥新亞藥業有限公司自主研發了硫酸多黏菌素E，該產品為含30余種組分的混合物，其中主要成分為多黏菌素E1和多黏菌素E2[5]。然而硫酸多黏菌素E缺乏足夠的藥動學數據，因此迫切需要一種快速、準確的多黏菌素E濃度測定方法，為臨床合理應用提供依據。

現有的多黏菌素E在生物樣本中的分析方法包括微生物分析法、免疫學分析法及高效液相色譜（HPLC）法。微生物法耗時且缺乏特異性，另由于多黏菌素E對紫外光吸收能力較差，缺乏天然熒光，因此用HPLC法測定存在檢測限無法達到臨床要求的問題[6]。近年來液相色譜串聯質譜（LC-MS/MS）法被廣泛用于生物樣品的藥物濃度測定。張莉婷等[7]采用蛋白沉淀法對人血漿中多黏菌素E總濃度進行測定，簡化了血漿預處理過程，然而蛋白沉淀法易受基質效應干擾；Gobin 等[8]采用固相萃取法，縮短了分析時間，但未對基質效應進行必要驗證；Dotsikas等[9]建立了一種全自動96孔固相萃取法，縮短了運行時間，降低了操作錯誤可能性；Zhao等[5]改進了固相萃取法，可同時測定人血漿中多黏菌素E1、E2及CMS濃度，但萃取過程中洗脫步驟較繁瑣。

本研究擬開發一種快速、簡便、靈敏度及準確度高的LC-MS/MS法，同時測定人血漿中多黏菌素E1和E2的濃度，采用固相萃取法，簡化洗脫步驟，提高檢測定量下限，并通過方法驗證確定分析方法的可靠性，再應用于多黏菌素E的臨床藥動學研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 Waters UPLC超高效液相色譜儀（美國Waters公司），API4000QTRAP質譜儀（美國AB SCIEX公司），MettlerTodelo XS 205電子分析天平（瑞士梅特勒公司），Thermo Forma 900低溫冰箱（-70℃）（美國Thermo 公司），Positive Pressure-96正壓固相萃取裝置（美國Waters公司），96孔固相萃取小柱（30 mg，美國Waters 公司）。

1.1.2 藥品 多黏菌素E（標準品：多黏菌素E1純度27.9%，多黏菌素E2純度46.8%，批號LN201812001-20190806），保 存 于（-20±5）℃冰箱中；多黏菌素B1（內標，純度96.2%，批號200421-1），保存于2～8 ℃冰箱中。上述藥品均由上海上藥新亞藥業有限公司提供。

1.1.3 試劑 甲醇（HPLC級）、乙腈（HPLC級）、氨水（化學純）、甲酸（分析純），以上試劑均購于Sigma-Aldrich公司，超純水（HPLC級，Millipore超純水系統）。空白血漿來源于復旦大學附屬華山醫院Ⅰ期臨床研究中心6名健康受試者（經過復旦大學附屬華山醫院倫理委員會批準），血漿均采集于EDTA-K2管中，離心后保存于-40℃冰箱。

1.2 方法

1.2.1 色譜、質譜條件 色譜柱為Phonomenex Kinetex XB-C18柱（100 mm×2.1 mm I.D.，2.6 μm）；流動相為0.1% 甲酸溶液∶乙腈-甲醇（體積比1∶1）梯度洗脫；流速0.4 mL/min；柱溫30.0℃；分析時間3.5 min；進樣體積3.0 μL。

采用電噴霧電離源（ESI 源），正離子多反應監測（MRM）掃描模式，噴霧電壓5.5 kV，離子源溫度550℃，氣簾氣25 psi（1 psi=6.895 kPa），Gas1（氮氣）50 psi，Gas2（氮氣）50 psi，多黏菌素E1、E2、B1（內標）的母離子/子離子分別為：m/z 390.7→101.3、m/z 386.0→101.2、m/z 402.3→101.2，去簇電壓分別為63 V、61 V和59 V，碰撞能量分別為28 V、27 V和28 V。

1.2.2 血漿標準曲線、質控樣品的配制 精密稱取多黏菌素E標準品配制貯備液，用20%乙腈稀釋貯備液，配制一系列多黏菌素E的標準曲線工作溶液（含多黏菌素E1濃度范圍為0.279～55.8 mg/L，多黏菌素E2濃度范圍為0.468～93.6 mg/L），低、中、高質控工作溶液（含多黏菌素E1濃度分別為0.837 mg/L、4.46 mg/L、44.6 mg/L；多黏菌素E2濃度分別為1.40 mg/L、7.49 mg/L、74.9 mg/L）。

取上述系列濃度的標準曲線及質控工作溶液各50 μL，分別加入空白血漿950 μL，配制為血漿中質量濃度分別為0.014 0 mg/L、0.027 9 mg/L、0.069 8 mg/L、0.140 mg/L、0.279 mg/L、0.698 mg/L、1.40 mg/L、2.79 mg/L的多黏菌素E1標準曲線樣品和血漿中質量濃度分別為0.023 4 mg/L、0.046 8 mg/L、0.117 mg/L、0.234 mg/L、0.468 mg/L、1.17 mg/L、2.34 mg/L、4.68 mg/L的 多 黏菌素E2標準曲線樣品，以及血漿中質量濃度分別為0.041 9 mg/L、0.223 mg/L、2.23 mg/L的多黏菌素E1質控樣品和質量濃度分別為0.070 2 mg/L、0.374 mg/L、3.74 mg/L的多黏菌素E2質控樣品。

1.2.3 內標工作液的配制 精密稱取多黏菌素B1標準品配制內標貯備液，用20%乙腈稀釋貯備液，配制濃度為8 mg/L的多黏菌素B1內標工作溶液。

1.2.4 血漿樣品處理方法 精密吸取200 μL血漿樣品加入50 μL內標工作溶液，加入5%氨水200 μL，渦旋混勻。吸取400 μL混合液加至預先使用1 mL甲醇和1 mL超純水活化的固相萃取板中，上樣后依次使用1 mL超純水和1 mL甲醇溶液洗凈小柱，300 μL的6%甲酸-30%乙腈水溶液洗脫，混勻后洗脫液3 μL進樣LC-MS/MS分析。

1.2.5 方法學驗證 分別測定來自6個不同健康受試者的空白血漿進行選擇性考察。按前述方法制得濃度分別為0.014 0～2.79 mg/L的多黏菌素E1和濃度分別為0.023 4～4.68 mg/L的多黏菌素E2標準曲線樣品，經預處理后進行測定，以多黏菌素E1或E2與內標的峰面積比值為縱坐標，多黏菌素E1或E2的濃度為橫坐標，采用1/x2加權的線性回歸擬合。另制備多黏菌素E血漿基質定量下限，及低、中、高濃度的質控樣品，至少3個分析批（至少2 d配制），每個濃度至少預處理5份后進樣，計算批內（n=6）、批間（n=18）精密度和批間準確度偏倚（%），精密度用變異系數（CV/%）表示。

在低、中、高質控濃度下考察不同個體空白基質對待測物及內標質譜信號的影響，人血漿方法學驗證同時考察正常血漿、溶血血漿、脂血血漿的基質效應。內標歸一化的基質效應因子=待測物面積比/內標面積比×100%，其中面積比=空白基質加入含藥緩沖液峰面積/含藥緩沖液溶液峰面積均值。另用混合空白血漿配制的低、中、高濃度質控樣品經預處理后進樣（6份），同時配制空白血漿處理后添加含藥溶液樣品（6份），計算提取回收率。提取回收率=質控樣品處理后待測物的面積/混合空白基質處理后加含藥溶液面積平均值×100% 。本研究考察了血漿樣品在 -20℃和-70℃冰箱存放71 d、反復凍融3次、樣品預處理前室溫放置18 h及制備后樣品于4℃放置48 h的穩定性。

1.2.6 受試者給藥、采血方案 經復旦大學附屬華山醫院倫理委員會批準，開展單中心開放試驗進行受試者靜脈輸注硫酸多黏菌素E的藥動學研究。在試驗前簽署知情同意書，告知受試者試驗目的、藥物特性及可能出現的藥物不良反應等。對所有受試者進行體格檢查，生命體征、心電圖及實驗室檢查。試驗藥物為注射用硫酸黏菌素（批號：200302， 50萬IU/瓶，上海上藥新亞藥業有限公司），給藥劑量為1 萬IU/kg（即0.452 mg/kg）， 靜脈滴注時間為2 h。留取受試者于給藥前 （0 h）和給藥后0.5 h、1 h、1.5 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、14 h、18 h、26 h、38 h、50 h的 靜 脈 血 4 mL，置于EDTA-K2管中，離心分離出血漿并保存于（-70±10）℃冰箱。采用已建立的LC-MS/MS法測定受試者血漿樣品中多黏菌素E1、E2的濃度。

2 結果

2.1 方法學驗證

選擇性考察結果顯示，血漿中的內源性物質在多黏菌素E1、E2、內標出峰位置均不存在干擾峰，不影響其分離測定。血漿中多黏菌素E1、E2、內標的保留時間分別為1.70 min、1.44 min、1.96 min。典型色譜圖見圖1。多黏菌素E1和E2的標準曲線回歸方程分別為y＝1.108 2x-0.000 6（R2=0.997 3），y＝1.204 4x+0.001 3（R2=0.997 7）。多黏菌素E1濃度于0.014 0～2.79 mg/L線性關系良好，定量下限為0.014 0 mg/L；多黏菌素E2濃度在0.023 4～4.68 mg/L線性關系良好，定量下限為0.023 4 mg/L。

多黏菌素E1批內和批間精密度分別為2.7%～10.2%和2.5%～9.0%，批間準確度偏差為 -4.5%～2.2%；多黏菌素E2批內和批間精密度分別為2.8%～7.5%和2.9%～5.3%，批間準確度偏差在-4.8%～4.3%。均符合生物樣品測定要求，見表1。

表1 血漿中多黏菌素E1、E2的批間及批內精密度和準確度偏倚結果Table 1 Assay precision and accuracy of polymyxin E1 and polymyxin E2 in human plasma（%）

多黏菌素E1在正常血漿、溶血血漿及脂血血漿中的內標歸一化基質效應因子為94.8%～102.3%，提取回收率為26.1%～29.4%；多黏菌素E2在正常血漿、溶血血漿及脂血血漿中的內標歸一化基質效應因子為93.1%～100.1%，提取回收率為29.2%～33.0%。基質效應和提取回收率平均值見表2。

表2 多黏菌素E1、E2基質效應與提取回收率Table 2 Matrix effects and recovery of polymyxin E1 and polymyxin E2 （%）

穩定性考察結果見表3，測定準確度分別為87.5%～101.4%（多黏菌素E1）和90.4%～103.9%（多黏菌素E2），表明多黏菌素E1、E2血漿樣品在 -20℃冰箱存放3 d、-70℃冰箱長期存放71 d、反復凍融3次、樣品預處理前室溫放置18 h及制備后樣品4℃放置48 h均能保持穩定。本研究中存放71 d的穩定性驗證可覆蓋臨床標本實際存放時間。

表3 血漿中多黏菌素E1、E2穩定性考察Table 3 Stability of polymyxin E1 and polymyxin E2 in human plasma（%）

2.2 多黏菌素E藥動學研究

測定結果顯示，本研究建立的方法可用于健康受試者體內多黏菌素E1、E2的血藥濃度測定。6名健康受試者接受單劑靜脈輸注多黏菌素E1、E2的平均血藥濃度-時間曲線見圖2，在靜脈輸注開始后2 h即可達到峰濃度。多黏菌素E1血藥峰濃度為0.428 mg/L，多黏菌素E2血藥峰濃度為0.676mg/L。

3 討論

與其他方法相比，本研究建立的LC-MS/MS法的優勢在于提高了檢測定量下限，縮短了分析時間，能夠準確測定人血漿中多黏菌素E1及多黏菌素E2的濃度，可為多黏菌素E的臨床藥動學血漿樣品檢測提供可靠方法。該檢測方法具有靈敏度高、分析時間短、進樣量少、選擇性強等特點，對基質效應及提取回收率考察結果顯示，回收率雖偏低但不同濃度間回收率一致，精密度及準確度均符合標準，故不影響測定。方法學驗證結果滿足藥動學研究原則中有關生物樣品分析的要求[10-13]。 在后續實際樣品檢測中，所有批次質控數據均 合格。

常用的生物樣品前處理方法一般包括蛋白沉淀、液液萃取、固相萃取等。本研究采用固相萃取法，與既往文獻報道的方法相比，能更有效地分離待測物與干擾組分，降低樣品基質干擾，提高檢測靈敏度。一般在流動相選擇上，乙腈作流動相的峰形較好，甲醇可提高質譜響應，甲酸有助于色譜改善峰形。由于難以獲得多黏菌素E的同核素內標，本研究中選擇結構類似物多黏菌素B1作為內標。經考察，該方法操作簡單，精密度與準確度良好，適用于多黏菌素E的臨床藥動學研究。