多重PCR技術在調查分析水族館海獸飼養環境中致病菌的應用

熊 冉，蕭 晟，陳文華

(1.蕪湖職業技術學院，安徽蕪湖 241003；2.應節(南京)智能科技有限公司，江蘇南京 210000)

0 引言

水族館行業是隨著社會發展進步于近些年新興的科普旅游行業，水族館作為集旅游、科普、展示和養殖于一體的經營場所，人員復雜、動物聚集且流動頻繁等因素導致各類病原體很容易在不同種類的動物和環境之間相互傳播，從而致使觀賞動物發生顯性或隱性感染.因此，利用準確、有效、快捷的方法調查分析其生活區域存在的致病菌十分必要，同時也可給予飼養繁育及臨床診療明確的指引[1].近年來，有學者對野生動物各類疫病都展開了調查研究，2019年，貴州省某野生動物園2只赤猴突然發病死亡，經檢驗確診本次疾病為魏氏梭菌感染[2]；2021年，秦皇島地區從水貂分離到的沙門氏菌均具有一定的致病力和多重耐藥性[3]；2016年孫泉云等利用PCR技術對上海地區規模豬場環境中的致病菌進行檢測[4]；2020年，沈燕等利用多重PCR技術對水環境中致病菌分子進行生物學檢測[1].

本實驗以某海族館海獸飼養環境為對象，先后兩次(隔半年)采用多重PCR技術快速檢測海獸飼養、表演環境中各類微生物的種類及數量，進而分析確定其中對海獸造成疾病危害的致病菌種類，更有利于園區對海洋哺乳動物健康的保障，為疾病防控工作提供理論依據.

1 材料與方法

1.1 檢測樣品

樣品主要來自海獸飼養區、飼養員辦公區以及海獸表演區，分別對不同區域進行環境致病菌污染狀況調查以及采樣工作，水族館各區域內隨機采樣，前后兩次采集棉拭子樣本共28份，具體分布如下(表1).

1.2 儀器設備

SW-CJ-2FD超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術有限公司；H1650R離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；NP968-S全自動核酸提取儀，西安天隆科技有限公司；Gentier 32R全自動PCR分析系統，西安天隆科技有限公司；BIOMRIEUX細菌鑒定儀，杭州怡藍生物技術有限公司.

1.3 檢測方法

樣本棉拭子經處理后接種培養基，增殖培養，采用常規微生物檢測方法[4-5]，通過分離純化，染色鏡檢、生化實驗等方式，結合細菌鑒定儀鑒別革蘭氏陰性菌、陽性菌或腐敗發酵菌等，將純化后的待檢菌液經熱處理后作為模板，使用通用引物，利用多重PCR技術擴增靶序列，經電泳初步鑒定，最后送至金斯瑞生物公司使用16S rRNA方式測序[6]，經GeneBank數據庫Blast序列比對最終得出結果.

1.4 數據統計

前后兩次對此海獸飼養環境不同區域進行采樣，第一次共采集棉拭子樣本11份，主要針對餌料區、辦公區和觀眾看臺區；第二次共采集棉拭子樣本17份，主要分布于海獸生活區(包括海水)、表演區后場至表演臺，檢測結果以樣品中各類微生物的檢出率進行統計[4].

2 結果與分析

2.1 兩次采樣檢測出的微生物種類及數量

根據前后兩次采樣檢測出的結果(表2)，兩次檢測的樣本分別檢測出13種微生物，其中均有惡臭假單胞菌、約氏不動桿菌、溶血不動桿菌和深海微小桿菌，其余小部分細菌由于陽性檢測率較低，不作為參考依據.在第一次收集到的11份棉拭子樣本中，惡臭假單胞菌和約氏不動桿菌數量均達19%，其次是綠色氣球菌和雙氮氧弧菌，各占9%，其余9種細菌分別占總數5%及以下；第二次收集到的17份棉拭子樣本中，嗜冷桿菌和惡臭假單胞菌數量各占18%，約氏不動桿菌、深海微小桿菌、熒光假單胞菌和海洋假單胞菌占9%，其余7種細菌占4%.這些細菌分布在海獸飼養管各個區域，主要侵害水生動物，在環境條件適宜時開始增殖分化，吸附于組織表面，致病性增強.

2.2 兩次檢測出的微生物分布區域及致病性

根據第一次樣本檢測數據分析(表3)，海洋館中存在較多的細菌為約氏不動桿菌和惡臭假單胞菌，其中約氏不動桿菌屬于腐敗菌，常見于水體和土壤中，易在潮濕環境中生存，粘附力極強；惡臭假單胞菌是水生動物常見的致病菌，主要分布在餌料間、海獅籠地面、兩側看臺樓梯，均與海獸直接接觸，應引起重視.

結果顯示，在本次分離到的13種細菌中，致病菌包括瓊氏不動桿菌、惡臭假單胞菌、河流漫游球菌、綠色氣球菌和溶血不動桿菌，這些細菌多存在于水生動物生存環境中，主要分布在海獅籠區域，兩側看臺樓梯(尤其是看臺西樓梯)以及舞臺區，飼養員每天接觸動物，或稱為攜帶者，有傳播到其他區域的潛在風險.

根據第二次樣本檢測數據分析(表4)，本次分離出來的菌主要有惡臭假單胞菌和嗜冷桿菌，嗜冷桿菌主要為環境菌，少數種類有致病性，分布區域主要是人員通道；惡臭假單胞菌為致病菌，主要分布在東池臺面及柵欄、餌料間、西柵欄及臺面、表演后場樓梯東，與第一次分離結果相似.分離到的13種細菌中致病菌有溶血不動桿菌、惡臭假單胞菌、豚鼠氣單胞菌、熒光假單胞菌、糞嗜冷桿菌，致病菌主要分布在衛生間走道、池臺面及柵欄、表演后場樓梯，飼養與馴導人員應注意及時消毒，避免攜帶感染.

3 討論

3.1 飼養環境定期消毒，保障動物健康

根據該水族館海獸飼養環境中致病菌的檢測結果和分布情況，說明目前該海獸飼養區域、表演區域及飼養員辦公區域惡臭假單胞菌、溶血不動桿菌等致病菌污染的普遍性.這些致病菌在海獸遭遇不良應激或者抵抗力下降時，很容易感染動物引發臨床癥狀.一般針對餌料臺面采用碘酸混合溶液(百勝)或癸甲溴銨溶液(百毒殺)定期消毒；海獅籠以及場地一般使用次氯酸鈉溶液等常規消毒劑；水體帶動物一般使用黃粉，嚴重時可用高錳酸鉀溶液；飼養員及工作人員接觸動物前后應做好全面消毒工作，及時清理動物糞便等其他廢棄物.

3.2 微生物快速檢測應定期化、常規化

水族館作為經營場所，人員及環境較為復雜，因此，微生物快速檢測應納入場館常規工作計劃，該方法快速有效，針對場館內各類水生、陸生動物生活環境中致病微生物監控提供重要依據.根據檢測結果，飼養員在日常動物管理過程中可避免交叉感染、重復感染，工作人員在清潔過程中更有針對性，對于各類疾病的防控起到重要作用.當地動物疫控相關部門也應加強監測和巡查，避免發生嚴重疾病傳播.