不同采收期迷迭香酸含量測定及響應面法優化提取工藝研究

王 瑩，王 瑛，曾祥輝，鄧 慧

（邵陽學院 食品與化學工程學院，湖南 邵陽 422000）

迷迭香因具有抗氧化、抑菌、安全無毒等特性利用價值廣泛，其中藥用價值、食用價值和工業價值均有概述和研究[1-6]。從迷迭香中可提取多種抗氧化元素，可分為水溶性和脂溶性兩類抗氧化劑，其中水溶性抗氧化劑的組成主要有迷迭香酸和綠原酸等，研究表明水溶性抗氧化劑主要被運用于食品加工和醫藥等方面[7]。

迷迭香被發現于歐洲及地中海沿岸，于曹魏時期引種至我國，在南北方均有栽種，由于我國南北方氣候差異大、土壤類型各異等環境影響，已有學者對不同產地、不同采收期的植物進行研究[8-11]。試驗以湖南省邵陽市種植的迷迭香為研究對象，以熱回流法為提取方法，通過HPLC 法對迷迭香酸得率進行檢測，篩選出最佳采收期的迷迭香后，通過單因素試驗和響應面優化試驗，進一步優化提取條件，為擴大迷迭香資源利用最大化提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

迷迭香，磷酸、甲醇均為色譜純，迷迭香酸標準品（HPLC 純度≥98%），大連美侖生物技術有限公司提供；無水甲醇、無水乙醇等均為分析純；去離子水為實驗室自制。

SY-1210 型恒溫水浴鍋，南京暢翔儀器設備有限公司產品；3H16RI 型臺式高速冷凍離心機，湖南赫西儀器裝備有限公司產品；BON-80 型電熱干燥箱，上海三騰儀器有限公司產品；SR-3000 型高效液相色譜儀，Thermo Fisher 公司產品。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣本預處理

將不同采收期的迷迭香置于45 ℃干燥箱中烘至恒質量，經粉碎機處理后過篩分別置于密封袋中保存，備用。

1.2.2 提取工藝流程

采用熱回流法[12]。迷迭香粉末→按比例加入溶劑提取→離心→定容→過微孔濾膜→成品→HPLC 檢測。

稱取定量迷迭香粉末置于燒瓶中，按所設定的提取條件采取回流法對迷迭香水溶性物質進行提取。將提取后的溶液離心并定容，取樣液過微孔濾膜進行HPLC 分析。

1.3 提取工藝優化

1.3.1 單因素試驗

稱取定量迷迭香粉末，以提取溫度（40，50，60，70，80 ℃）、提取時間（40，50，60，70，80 min）、乙醇體積分數（40%，50%，60%，70%，80%） 和料 液 比（1 ∶10，1 ∶20，1 ∶30，1 ∶40，1 ∶50（g∶mL）） 為影響因素，在固定其中3 個提取條件不變的情況下，考查4 個影響因素在不同水平下對迷迭香酸得率的影響。

1.3.2 響應面試驗

通過單因素試驗得出最優的提取條件后，采用Design Expert 8.0.6 進行Box-behnken 方法設計，響應面試驗設計為四因素三水平，以提取溫度50 ℃，乙醇體積分數50%，提取時間70 min，料液比1∶20 為中心試驗點展開試驗。

響應面優化的因素與水平設計見表1。

表1 響應面優化的因素與水平設計

1.4 迷迭香酸含量測定

1.4.1 色譜條件

參考GB 1886.172—2016，使用高效液相色譜法測定迷迭香酸的含量[13]。使用C18反向色譜柱（4.6 mm×250 mm×5 μm），設置流動相B 為0.5 %磷酸- 甲醇（體積比為55∶45），檢測波長為283 nm，柱溫為40 ℃，流速為0.6 mL/min，進樣量為10 μL，檢測時間15 min。

1.4.2 標準曲線的建立

精密量取迷迭香酸標準品，溶解制成0，0.125，0.250，0.500，1.000 mg/mL 質量濃度的標準品溶液，參考1.4.1 色譜條件進行色譜分析。以迷迭香酸含量為橫坐標，色譜峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，以峰面積（Y） 對標準品濃度（X） 進行回歸分析，得到方程Y=322.028 1X-5.027 8，其相關系數R2=0.999 9，此方程可精確計算出迷迭香樣品中迷迭香酸的具體含量。

1.4.3 迷迭香酸得率的計算

以HPLC 分析，積分計算樣品溶液迷迭香酸吸收峰面積，帶入標準曲線方程計算迷迭香酸質量濃度。按下式計算迷迭香酸得率（Y）。

式中：c——迷迭香酸樣品質量濃度，mg/mL；

V——試樣溶液定容體積，mL；

m——試樣質量，mg。

1.5 數據分析

用Excel、Design Expert 8.0.6.1 等軟件進行繪圖、響應面優化等數據分析。

2 結果與分析

2.1 不同采收期迷迭香中迷迭香酸含量的測定

不同采收期迷迭香中迷迭香酸含量見表2。

表2 不同采收期迷迭香中迷迭香酸含量/%

迷迭香酸含量呈先升后降的趨勢，當生長時間為10 個月時其含量最高，為0.148%；當采收期為8 個月、24 個月時，分別為0.138%和0.142%。由此可見，在迷迭香的生長過程中，當采收期為10 個月時迷迭香酸含量已達最高值，考慮到實際應用價值和經濟效益，故選取采收期為10 個月的迷迭香樣品進行后續試驗。

2.2 單因素試驗

2.2.1 提取溫度對迷迭香酸得率的影響

提取溫度對迷迭香酸得率的影響見圖1。

圖1 提取溫度對迷迭香酸得率的影響

由圖1 可知，在40～80 ℃范圍內，迷迭香酸得率隨溫度變化呈上升趨勢，當溫度為50 ℃時達到較高值，而后在50～80 ℃范圍內迷迭香酸得率相差量小。分析原因可能是，當水溫在50 ℃以下時，未達到迷迭香酸的溶點，致使迷迭香酸的溶出率較低；但由于迷迭香酸的耐熱性較好，所以當水熱在一定范圍內時，迷迭香酸溶出率的差異較小，基于實際應用價值，故選取50 ℃為提取迷迭香酸的最佳溫度。

2.2.2 提取時間對迷迭香酸得率的影響

提取時間對迷迭香酸得率的影響見圖2。

圖2 提取時間對迷迭香酸得率的影響

由圖2 可知，在40～80 min 內，迷迭香酸得率隨提取時間的延長而逐漸上升，當提取時間為70 min時達到峰值，之后隨時間的增加而下降。這可能是由于迷迭香酸的穩定性較差，長時間的提取使其他副產物溶出，造成迷迭香酸含量降低的現象，因此選取70 min 為最佳提取時間。

2.2.3 乙醇體積分數對迷迭香酸得率的影響

乙醇體積分數對迷迭香酸得率的影響見圖3。

圖3 乙醇體積分數對迷迭香酸得率的影響

由圖3 可知，乙醇體積分數為40%～80%時，迷迭香酸得率總體呈先升后降的趨勢，當乙醇體積分數為50%時，迷迭香酸得率達到峰值，之后迷迭香酸的得率隨乙醇體積分數的提高而下降。可能是由于迷迭香酸為水溶性物質，低體積分數的乙醇更利于其溶出，而高體積分數的乙醇會使其他的物質溶出增多，使得迷迭香酸得率下降[14]，故選取50%為最佳乙醇體積分數。

2.2.4 料液比對迷迭香酸得率的影響

料液比對迷迭香酸得率的影響見圖4。

圖4 料液比對迷迭香酸得率的影響

由圖4 可知，料液比在1∶10～1∶50 范圍內，迷迭香酸得率大致呈先增后減現象，在1∶10～1∶20時該得率大幅度上升，但當料液比大于1∶20 時，迷迭香酸得率隨料液比的增加變化量小。可能是由于適當增加溶劑用量會提高迷迭香粉末與溶劑的溶解度，有助于溶出迷迭香酸，但當料液比超過1∶20時，迷迭香酸溶出速率達動態平衡，導致其他活性成分與迷迭香酸產生相互溶出的競爭關系，迷迭香酸提取量反而降低，加之過多的提取溶劑會造成資源浪費和成本增加[15]。故選取1∶20 為最優料液比。

2.3 響應面試驗結果與分析

2.3.1 響應面回歸模型的建立與分析

在單因素試驗的基礎上，以提取溫度（A）、乙醇體積分數（B）、料液比（C） 及提取時間（D） 為試驗因子進行四因素三水平Box-behnken 試驗設計，以迷迭香酸得率（Y） 為響應值，得到在不同條件下提取迷迭香酸的結果。

響應面試驗設計及結果見表3。

表3 響應面試驗設計及結果

運用Design Expert 8.0.6 進行回歸分析得到迷迭香酸得率（Y） 的回歸方程為：

迷迭香酸得率方差分析見表4。

由表4 可知，該回歸模型F=96.44，p<0.000 1，表明該試驗的回歸方程呈極顯著水平，表明該模型有較高可信度，該方程可以較好地預測迷迭香酸的得率。模型的決定系數R2=0.989 7，調整決定系數R2Adj=0.979 5，說明該模型可以應用于分析迷迭香酸得率變化情況，擬合度較高。失擬項p=0.547 6>0.05，差異不顯著，表明未知因素對試驗結果影響較小，模型內容合適，可應用于對迷迭香酸提取工藝優化進行分析。除此之外，由表4 可知，料液比的影響極顯著，乙醇體積分數的影響顯著，根據F 值可知，各因素對迷迭香酸得率的影響情況依次為C>B>A>D；二次項A2、B2、C2、D2均達到極顯著水平（p<0.01）。

表4 迷迭香酸得率方差分析

2.3.2 因素間交互作用分析

考查了提取溫度、乙醇體積分數、提取時間和料液比這4 個影響因子中各因素間的相互作用對迷迭香酸得率產生的影響。

各因素間交互作用對迷迭香酸得率的影響見圖5。

在響應面圖中，如果圖中坡度越陡則表示迷迭香酸的提取率受該因素的影響越大，反之則影響次之。由圖5 可知，料液比的增加明顯促進了迷迭香酸的得率，當料液比為1∶10～1∶20（g∶mL） 時，迷迭香酸得率顯著增長，說明料液比對迷迭香酸得率的影響極大；此外，當提取溫度在40～60 ℃時，迷迭香酸得率較為一致，說明該影響因素的變化對迷迭香酸得率的影響較小，該結果與方差分析的結果相一致。

圖5 各因素間交互作用對迷迭香酸得率的影響

根據響應面優化試驗得出最佳提取條件為提取溫度50.63 ℃，提取時間69.45 min，料液比1∶23.66（g∶mL），乙醇體積分數50.94%，迷迭香酸得率預測值為1.27%。根據實際情況將提取條件整合為提取溫度51 ℃，提取時間69 min，料液比1∶24（g∶mL），乙醇體積分數51%，在此條件下進行3 次水平試驗，平均得率為1.24%，實際結果與預測結果誤差為0.03%（<5%），說明模型預測值與試驗驗證值之間差異較小，證明此模型具有較高可行性。

2.4 方法可行性分析

2.4.1 重復性試驗

定量稱取迷迭香粉末，按上述最優工藝參數進行回流提取，分別取6 份提取液供HPLC 分析，經計算可知迷迭香酸得率為1.23%，與預測值誤差僅為0.04%，說明重復性較好[16]。

2.4.2 穩定性試驗

以最優工藝參數制作提取液，置于室溫保存，分別于0，2，4，6，8 h 進樣檢測，記錄迷迭香酸樣品量，計算各樣品間的標準偏差為SD=0.05%，表明該提取液在室溫下8 h 內較穩定[16]。

3 結論

通過對5 個不同采收期的迷迭香進行含量測定，得到迷迭香酸含量最高的采收期為10 個月，該采收期的迷迭香中抗氧化物質含量高，且采收期較短，可更好地為迷迭香產業化發展助力。后又以該采收期的迷迭香進行單因素試驗和響應面分析，對迷迭香酸的提取條件進行優化。試驗表明，在提取溫度為51 ℃，提取時間為69 min，料液比為1∶24（g∶mL），乙醇體積分數為51%時，迷迭香酸得率為1.26%，與模型預測值1.27%無顯著差異，且該模型調整決定系數R2Adj=0.979 5，證明該方案具有較高可行性。研究成果對湖南省邵陽市種植迷迭香的生產具有指導意義，同時為該地區迷迭香生產加工和迷迭香酸提取工業化提供理論基礎。