辣木茶多酚提取工藝優化及其體外抗氧化活性

余 芳，汪洪濤，鄭夢瑤，朱龍龍

（1. 江蘇經貿職業技術學院健康學院，江蘇南京 211168；2. 江蘇省食品安全工程技術研究開發中心，江蘇南京 210000；3. 南京諾衛檢測有限公司，江蘇南京 211168）

0 引言

辣木（Moringa oleifera Lam） 為辣木科辣木屬植物，我國南方地區多有種植。辣木葉和辣木籽是極具開發潛力的新資源食品，具有降低血壓和膽固醇、抗氧化、抑菌、輔助減肥等作用[1-3]。辣木鮮葉在印度被當成蔬菜食用，在我國主要做成茶葉飲用[4]。辣木籽具有豐富的營養價值，其蛋白質含量為35.8%，多糖含量為19.1%[5]。辣木茶是新鮮辣木葉經過清洗、晾曬、攤涼、萎凋、殺青、攤涼、渥堆、揉捻、烘干等工藝制成，采用類似茶葉沖泡（浸泡或煮） 的方式供人們飲用的產品[6-7]。辣木茶富含蛋白質、多酚類物質及礦物元素[8-10]，能夠降低老年人的尿酸水平[11]，對氯氰菊酯誘導的雌性大鼠肝腎功能損傷、氧化應激及組織病理學改變的保護作用，對·OH 和·O2-具有較強的清除作用[12-14]。

目前，有學者研究了辣木葉多酚提取及抗氧化活性[15-16]，辣木葉發酵制成的辣木茶生物活性研究較少。試驗以市售辣木茶為原料，參照人們日常飲茶的生活習慣，通過高溫水提的方式，考查料液比、提取溫度、提取時間對辣木茶多酚提取量的影響。采用單因素試驗和Box-behnken 響應面試驗，優化辣木茶多酚提取工藝，選擇最佳提取工藝參數。測定清除DPPH 自由基能力、超氧陰離子清除能力及總還原力，評價辣木茶溶液體外抗氧化活性，以期深入開發利用辣木保健茶資源。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

辣木茶，市售，產自云南昆明，水分含量5.8%，經高速萬能粉碎機粉碎后，密封儲存于冰箱-18 ℃冷凍層備用；沒食子酸標準品、福林酚試劑、Tris-HCl、維C 標準品、DPPH 等，均為分析純。

1.2 儀器設備

FW100 型高速萬能粉碎機，天津市泰斯特儀器有限公司產品；BSA224S 型電子天平，賽多利斯科學儀器有限公司產品；JH 722s 型可見光分光光度計，上海菁華儀器儀表有限公司產品。

1.3 試驗方法

1.3.1 辣木茶多酚含量測定

按照《GB/T 8313—2018 茶葉中茶多酚及兒茶素類檢測方法》[17]，配制沒食子酸標準儲備液和系列標準溶液，加入10%福林酚試劑5 mL，搖勻，反應5 min，再加入7.5% Na2CO3溶液4 mL，室溫靜置60 min，于波長765 nm 處測定吸光度，得到回歸方程Y=0.246 4X+0.042 2，R2=0.998 8。該測定方法線性關系良好，依此進行辣木茶多酚含量測定。

1.3.2 辣木茶多酚提取工藝單因素試驗

稱取辣木茶粉2 g，固定溫度70 ℃，浸提時間30 min，設定料液比1∶20，1∶30，1∶40，1∶50，1∶60；固定料液比1∶30，溫度70 ℃，設定提取時間10，20，30，40，50 min；固定料液比1∶30、浸提30 min，設定提取溫度50，60，70，80，90 ℃，測定辣木茶多酚提取量。

1.3.3 辣木茶多酚提取工藝響應面試驗設計

根據1.3.2 單因素試驗結果，設計Box-behnken響應面試驗，以辣木茶多酚提取量為考查指標。

Box-behnken 中心組合設計因素與水平設計見表1。

表1 Box-behnken 中心組合設計因素與水平設計

1.3.4 辣木茶體外抗氧化試驗

（1） 辣木茶清除DPPH 自由基能力測定。分別稱取0，0.125，0.250，0.500，1.000，2.000 g 的辣木茶粉，加入80 ℃水溶解，冷卻后定容到100 mL，配制質量濃度分別為0，1.25，2.50，5.00，10.00，20.00 mg/mL 的辣木茶溶液，過濾取濾液，根據Vattem D A 等人[18]方法對其進行DPPH 自由基清除率測定，以相同濃度的維C 溶液為陽性對照，并按下式計算不同溶液對DPPH 自由基的清除率。

式中：A0——2 mL DPPH+2 mL 70%乙醇溶液于波長517 nm 處測得的吸光度；

Ai——2 mL DPPH+2 mL 辣木茶溶液于波長517 nm 處測得的吸光度；

Ai0——2 mL 70%乙醇溶液+ 2 mL 辣木茶溶液于波長517 nm 處測得的吸光度。

（2） 辣木茶對·O2-的清除能力測定。取1.3.4（1） 相同質量濃度的辣木茶溶液，進行·O2-的清除能力測定，以相同質量濃度的維C 溶液為陽性對照。參照張秀芬等人[14]方法，配制0.05 moL/L，pH 值8.2的Tris-HCl 溶液、45 mmoL/L 鄰苯三酚溶液備用。于10 mL 試管中依次加入試劑，反應4 min，測定波長340 nm 處不同樣品液的吸光度，按式計算·O2-清除率：

式中：A0——2.55 mL Tris-HCl+0.05 mL 鄰苯三酚+0.4 mL 蒸餾水于波長340 nm 處測得的吸光度；

A1——2.55 mL Tris-HCl+0.05 mL 鄰苯三酚+0.4 mL 辣木茶溶液于波長340 nm 處測得的吸光度；

A2——2.55 mL Tris-HCl+0.4 mL 辣木茶溶液+0.05mL 蒸餾水于波長340 nm 處測得的吸光度。

（3） 辣木茶總還原力測定。分別稱取0，0.020，0.040，0.060，0.080，0.100 g 的辣木茶粉，加入80 ℃水溶解，冷卻后定容到100 mL，配制成0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mg/mL 的辣木茶溶液，過濾后進行總還原力測定，以0，0.02，0.04，0.06，0.08，0.1 mg/mL 維C 溶液為陽性對照。參照裴斐等人[15]方法，取不同質量濃度的樣品液1.0 mL，測定其波長700 nm 吸光度。

1.4 數據處理

利用Design Expert 8 軟件對試驗數據進行回歸擬合，p<0.05，差異顯著；p<0.01，差異極顯著。測定結果均平行重復3 次，取其平均值。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

料液比對辣木茶多酚提取量的影響見圖1，提取時間對辣木茶多酚提取量的影響見圖2，提取溫度對辣木茶多酚提取量的影響見圖3。

圖1 料液比對辣木茶多酚提取量的影響

圖2 提取時間對辣木茶多酚提取量的影響

圖3 提取溫度對辣木茶多酚提取量的影響

由圖1 可知，隨著料液比的增大，辣木茶多酚提取量在不斷增大，1∶40 時多酚提取量達到最高值，這是由于溶劑用量增加有利于多酚的溶出。隨著料液比從1∶50 開始，提取量有所下降，說明隨著溶劑量的增加，提取過程中溶出的其他水溶性物質如多糖等，影響了辣木茶多酚的提取分離。由圖2可知，20 min 時達到最大提取量，表明提取液中多酚已基本溶出，提取時間過長會導致茶多酚被氧化而降低[14]。依據日常飲茶習慣的時間間隔，以及多酚的變化規律，選擇水提時間10，20，30min 作為響應面試驗的3 個水平。由圖3 可知，隨著溫度的升高，溶液的分子運動加快，多酚的溶解度不斷增大，且高溫導致細胞膜破損，有利于有效成分的溶出[19]。溫度選擇要考慮到日常沏茶常用水溫度及飲茶習慣溫度。

2.2 辣木茶多酚提取工藝響應面試驗

依據單因素試驗進行辣木茶多酚提取工藝的Box-behnken 響應面試驗，按照表1 的設計方案，以辣木茶多酚提取量為考查指標，17 個不同組合的試驗結果。

Box-behnken 響應面法試驗結果見表2。

表2 Box-behnken 響應面法試驗結果

2.3 響應面回歸模型的方差分析

應用Design Expert 8 軟件對表2 的試驗結果回歸擬合，得到A、B、C 各因素對辣木茶多酚提取量（Y） 影響的二次多項回歸模型方程：

回歸模型方差分析見表3。

表3 回歸模型方差分析

由表5 可知，F=20.99，p=0.000 3<0.01，回歸模型顯著，擬合程度和可信度較好，試驗誤差較小，極顯著。其中，料液比和提取溫度2 個因素對辣木茶多酚提取量的影響極顯著，模型失擬項不顯著（p=0.758 8>0.05），則此模型擬合度良好。

2.4 提取工藝條件的響應曲面分析

根據Design Expert 8 軟件對表4 數據進行回歸擬合分析，得到不同提取條件對辣木茶多酚提取量影響的三維響應面圖。

兩因素的交互作用對辣木茶多酚提取量的影響見圖4。

圖4 兩因素的交互作用對辣木茶多酚提取量的影響

由圖4 可知，兩因素的交互作用對辣木茶多酚提取量的影響，分析3 個響應面曲線圖可知，料液比與提取溫度2 個因素對辣木茶多酚提取量的影響顯著，曲線較為陡峭，提取時間對辣木茶多酚提取量的影響較小，曲線較為平緩。

2.5 提取參數優化及模型驗證

應用Design Expert 8 軟件進行最佳提取條件為料液比1∶42.12，提取時間19.35 min，提取溫度83.81 ℃，多酚提取量為32.13 mg/g。提取工藝修正為料液比1∶40，提取時間20 min，提取溫度80 ℃。在此優化條件下提取辣木茶多酚，實際提取量為31.67±1.48 mg/g，與理論值非常接近，說明該多元二次回歸方程能夠準確預測辣木茶多酚的實際提取量。Fombang E N 等人[20]利用響應面法優化提取條件溫度、料液比和時間，制備具有抗氧化潛力的富含植物化學的辣木功能性茶為料液比1∶20（mg∶mL），提取溫度97 ℃，提取時間35 min，總多酚的最佳提取量為56.96 mg/g。研究相比之下減少了提取時間，降低了提取溫度，與后者料液比相差1 倍，稀釋后多酚提取量接近或超過，因此更符合日常多開飲茶習慣。

2.6 辣木茶溶液體外抗氧化活性

2.6.1 辣木茶清除DPPH 自由基能力

DPPH 是在含有自由基的化學反應中作為一種監測反應的物質，典型地用于實驗室研究中抗氧化成分的體外抗氧化性評價。

辣木茶溶液與維C 溶液清除DPPH 自由基能力見圖5。

圖5 辣木茶溶液與維C 溶液清除DPPH 自由基能力

由圖5 可知，質量濃度為1.25～20.00 mg/mL 時，辣木茶溶液具有很強的清除DPPH 自由基能力，清除率為94.10%～93.72%，質量濃度為1.25～10.00 mg/mL時，辣木茶溶液清除DPPH 自由基能力高于同濃度維C。

2.6.2 辣木茶對·O2-的清除能力

超氧陰離子（·O2-） 與羥基（-OH） 結合后的產物會導致細胞DNA 損壞，應用清除超氧陰離子（·O2-） 能力可評價抗氧化能力。

辣木茶溶液與維C 溶液清除·O2-能力見圖6。

圖6 辣木茶溶液與維C 溶液清除·O2-能力

由圖6 可知，質量濃度1.25～20.00 mg/mL 范圍內的辣木茶溶液具有一定的清除超氧陰離子能力，并隨著質量濃度的增大而逐漸增高，20 mg/mL 時達到36.65%，相當于同濃度維C 溶液（91.16%） 的40.20%。

2.6.3 辣木茶總還原力

利用抗氧化劑將鐵氰化鉀還原為亞鐵氰化鉀，亞鐵氰化鉀再利用三價鐵形成普魯士藍，可由波長700 nm 處的吸光度變化來檢測總還原力大小[21]。

辣木茶溶液與維C 溶液總還原力見圖7。

圖7 辣木茶溶液與維C 溶液總還原力

由圖7 可知，在質量濃度0.2～1.0 mg/mL 范圍內，辣木茶溶液和維C 溶液的吸光值隨著質量濃度的增加而增大，說明其總還原力隨著質量濃度的增大而逐漸升高。在質量濃度為0.2～0.6 mg/mL 時，辣木茶溶液和維C 溶液的吸光度很接近，在質量濃度1.0 mg/mL 時，辣木茶溶液的總還原力為0.579，維C溶液總還原力為1.241。

Sugahara S 等人[13]研究結果表明，辣木茶熱水提取物具有較強的清除DPPH 自由基和超氧陰離子能力，并隨著質量濃度的增大而逐漸增高，其EC50 分別為73.7 μg/mL 和246 μg/mL。Fombang E N 等 人[20]試驗結果表明，在該優化提取條件下制備的辣木茶多酚對DPPH 自由基的清除率為81%，略高于抗壞血酸維C（77%），總還原能力為1.75 g 抗壞血酸當量/100 g。

3 結論

依據日常的飲茶習慣，選取了定比熱水浸提的單因素試驗和Box-behnken 響應面試驗，優化辣木茶多酚提取工藝為料液比1∶42.12，提取時間為19.35 min，提取溫度83.81 ℃，修正后的優化條件下多酚提取量為31.67±1.48 mg/g，所得回歸模型應用性良好。測定辣木茶溶液的清除DPPH 自由基能力、清除超氧陰離子能力及其總還原力，證明了辣木茶具有一定的體外抗氧化活性，為開發辣木保健茶資源提供理論基礎。辣木茶發酵過程中是否造成多酚的富集，以及辣木茶多酚是否為辣木茶體外抗氧化活性的主要貢獻者等科學問題，還有待進一步驗證。