碳[13C]-尿素中基因毒性雜質的來源分析與去除方法

魏翠雯，陳 凱，陳堅明，張旭杰

（深圳市中核海得威生物科技有限公司，廣東深圳 518000）

碳[13C]-尿素的制劑用于呼氣試驗診斷幽門螺桿菌感染，幽門螺桿菌是一種可以在胃中生長的細菌，可導致胃炎、消化性潰瘍，并與胃癌密切相關。碳[13C]-尿素生產工藝的一大難點是基因毒性雜質的控制，分析碳[13C]-尿素生產過程中基因毒性雜質的來源和有效去除，對提升藥品質量具有重要意義。

碳[13C]-尿素生產過程中產生的基因毒性雜質包括氨基甲酸甲酯和氨基甲酸乙酯，氨基甲酸甲酯（MC）、氨基甲酸乙酯（EC）分別被國際癌癥研究機構（IARC）歸類為3類和2A類致癌物[1]。1943年Nettleship等[2]發現了氨基甲酸乙酯致癌以來，人們對于其致癌機理和致癌作用不斷地研究和探討[3]，發現氨基甲酸乙酯在嚙齒類動物，如大鼠、小鼠、倉鼠、猴子等體內均具有致癌性。在人體內，氨基甲酸甲酯、氨基甲酸乙酯的代謝與嚙齒類動物中的代謝途徑是類似的，是一種潛在的致癌物。在生物體內，氨基甲酸甲酯、氨基甲酸乙酯能迅速、幾乎完全被腸道、皮膚吸收，會導致體內多位點致癌。

1 碳[13C]-尿素的生產工藝

基于Franz R.A.和Applegath F.的基本原理（有機化學（1961），第26卷，第2604-2605頁），設計生產工藝如圖1所示：

圖1 設計生產工藝圖

2 碳[13C]-尿素中基因毒性雜質產生的機理分析

Ough[4]在1976年的研究中，發現尿素與乙醇在室溫條件下反應72h會產生氨基甲酸乙酯，氨基甲酸乙酯的形成不僅與尿素、乙醇的濃度有關，還與貯藏溫度有較大關系，也有研究報道，氨基甲酸乙酯的形成速度與溫度呈線性關系[5]。

碳[13C]-尿素生產過程中，在加熱條件下脫出一分子的氨氣轉化為中間體A，中間體A化學性質不穩定，在反應體系中可能發生以下副反應，如圖2所示：

圖2 碳[13C]-尿素中氨基甲酸酯的形成機理

（1）在合成反應和干燥除硫階段，與甲醇發生加成反應會生成氨基甲酸甲酯。

（2）在重結晶階段，與乙醇發生加成反應會生成氨基甲酸乙酯。

對碳[13C]-尿素各個工藝環節的氨基甲酸甲酯、氨基甲酸乙酯進行研究，結果表明，氨基甲酸甲酯產生于合成反應步驟，在干燥和重結晶步驟中去除；氨基甲酸乙酯產生于重結晶步驟，養晶結束后通過減壓抽濾進入碳[13C]-尿素母液。說明干燥工藝對氨基甲酸甲酯有很好的去除效果，重結晶工藝對于氨基甲酸甲酯、氨基甲酸乙酯有很好的去除效果，去除的氨基甲酸甲酯、氨基甲酸乙酯被富集于母液中，須進一步研究干燥工藝和母液蒸干工藝。

3 碳[13C]-尿素生產中基因毒性雜質的去除方法

3.1 減少基因毒性雜質的產生

3.1.1 優化合成反應時間

氨基甲酸甲酯主要產生于合成反應過程，尿素在加熱條件下，脫去一分子氨后，與甲醇發生加成反應，生成副產物氨基甲酸甲酯。按合成反應方程式CO、NH3投料比例應為1∶2，但因13CO價格昂貴，按同位素尿素合成一般采用非同位素原料過量投料，確定13CO、NH3投料比例為1∶5，可獲得較高收率。根據實驗研究結果，尿素合成的較佳溫度為120℃，反應釜內的壓力經8～24h后，合成反應基本完成，綜合考慮提高13CO的反應率和控制雜質的產生，規定壓力穩定1h后，結束合成反應。繼續延長反應時間，13CO的反應率提升程度很有限，同時還會增加氨基甲酸甲酯、縮二脲等合成副產物的產生。

3.1.2 重結晶采用梯度升溫設計

氨基甲酸乙酯主要產生于重結晶階段，碳[13C]-尿素在加熱條件下，脫去一分子氨后，與乙醇發生加成反應，生成副產物氨基甲酸乙酯。在與重結晶工藝相同條件下，使用1.1kg普通尿素進行模擬，分別采用直線升溫和梯度升溫兩種方案進行對比。結果表明，采用直線升溫工藝，重結晶階段產生氨基甲酸乙酯為0.09%；采用梯度升溫工藝，分別在50℃、60℃、70℃、80℃、90℃保持20min，重結晶階段產生氨基甲酸乙酯為0.04%。說明采用梯度升溫設計，可有效減少氨基甲酸乙酯的產生。

因此，重結晶工藝采用梯度升溫的設計，可有效減少氨基甲酸乙酯的生成。

3.2 去除基因毒性雜質

3.2.1 優化干燥2工藝

使用1.1kg普通尿素添加0.5%氨基甲酸甲酯的方式進行模擬，考察干燥時間對氨基甲酸甲酯的影響，結果見圖3。結果表明，氨基甲酸甲酯隨著干燥時間的延長迅速下降，干燥時間6h后，到達平臺期，為了充分保證去除效果，干燥2時間應控制在不少于8h。

圖3 干燥2過程中氨基甲酸甲酯的變化圖

3.2.2 優化母液干燥工藝

在母液干燥過程的不同時間點取樣檢測，氨基甲酸甲酯、氨基甲酸乙酯的含量隨母液干燥時間的變化情況見圖4。結果表明，延長母液干燥時間，可顯著降低母液中氨基甲酸甲酯、氨基甲酸乙酯的含量，在干燥至6h后，降低至平臺期，因此，應控制母液干燥時間不少于6h。

圖4 母液干燥過程中氨基甲酸酯的變化圖

3.2.3 控制母液干燥品的加入比例

母液干燥品中碳[13C]-尿素的含量占90%以上，以1kg/批為例，產生的母液干燥品約250g，即每個批次約有25%的活性成分進入了母液，有必要對母液進行回收。但為了避免基因毒性雜質隨著母液套用次數的增加而產生富集，應嚴格控制母液干燥品中的基因毒性雜質含量，當母液干燥品中基因毒性雜質含量明顯高于終產品限度時，應按照工藝去除能力折算，嚴格控制母液干燥品的套用比例。

4 結論

氨基甲酸甲酯、氨基甲酸乙酯作為碳[13C]-尿素中一種潛在致癌的副產物，嚴重影響產品的質量和用藥安全性，對患者的健康存在不利影響。研究如何在碳[13C]-尿素生產過程中嚴格控制氨基甲酸甲酯、氨基甲酸乙酯的含量有著重要意義。

1）碳[13C]-尿素生產過程中，氨基甲酸甲酯產生于合成反應步驟，反應壓力穩1h后，結束合成反應，可有效減少氨基甲酸甲酯的產生；氨基甲酸乙酯產生于重結晶步驟，采用梯度升溫的方式溶解，可有效減少氨基甲酸乙酯的產生。

2）延長干燥2步驟的時間，對去除氨基甲酸甲酯有明顯效果，控制干燥2時間不少于6h，可有效控制碳[13C]-尿素成品中的氨基甲酸甲酯含量。

3）為避免母液干燥工藝產生氨基甲酸甲酯、氨基甲酸乙酯的富集，應控制母液干燥品中的氨基甲酸甲酯、氨基甲酸乙酯不得過0.1%。母液干燥時間不少于6h。