2-甲氧雌二醇對胎兒生長受限胎盤血管內皮功能的影響

花玉蓉，朱 怡，吳金婷，金彥琪

(南通大學附屬婦幼保健院婦產科，江蘇 南通 226001)

胎兒生長受限(fetal growth restriction，FGR)是新生兒圍產期重要疾病類型，不僅會導致新生兒病亡率增加，還會誘使患兒在成年后心血管疾病及耐糖量異常發生風險增加[1-2]。目前已經明確FGR的發生與胎盤血管重塑及滋養層細胞生物學行為異常有關，滋養層細胞與血管內皮細胞之間增殖、分化存在輕微協調機制，而這一機制需要胎盤組織分泌細胞因子參與。血管緊張素-2(angiotensin 2，Ang-2)為典型的血管生成激活因子，胎盤組織中Ang-2水平減少，一方面會抑制滋養細胞分化增殖，導致胎盤血管發育被抑制，胎盤血氧缺乏；另一方面其又可以經由抑制凋亡及促進遷移影響血管內皮細胞功能，進而導致FGR發病[3]。2-甲氧雌二醇(2-methoxyestradiol，2-ME)為17β-雌二醇2號位被細胞色素P450羥化，經由兒茶酚氧位甲基轉移酶(catechol O-methyltransferase，COMT)催化作用形成代謝產物[4]。已有研究顯示，在氧氣缺乏情況下，2-ME可以經由促進滋養細胞的遷移、增殖作用誘導滋養層細胞分化為高侵襲性滋養細胞，進而促進滋養細胞侵入細胞外基質，保證正常妊娠[5]。目前已經了解到FGR的發生與胎盤發育有關，且2-ME在滋養細胞分化中發揮重要作用，而2-ME在FGR中的作用及其在胎盤血管形成中的作用尚未完全明確。因此，本研究對FGR孕婦外周血、臍血及胎盤組織的2-ME水平變化進行探討，并應用體外細胞實驗分析2-ME對胎盤血管形成的影響，為后期從代謝方面分析FGR發病機制提供參考意見。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2019年5月至2020年12月期間南通大學附屬婦幼保健院收治的FGR孕婦66例及正常產檢孕婦50例為研究對象，將其分為研究組和健康組。

納入標準：①依據有關文獻[6]中對應標準判定孕婦是否存在FGR；②均為單胎妊娠，且為孕晚期；③應用剖宮產進行分娩；④孕婦及其家屬同意參與本研究，本研究獲我院醫學倫理委員會批準同意。排除標準：①存在心臟疾病、慢性高血壓、甲狀腺功能異常、肝腎疾病或者糖尿??；②存在產科合并癥或者其他內科合并癥；③多胎妊娠孕婦；④存在感染性疾病或者免疫異常疾病。

研究組的年齡為21～32歲，平均(26.59±4.19)歲；分娩孕周為36～40周，平均(38.29±0.94)周；孕次1～3次，平均(2.13±0.53)次；產次1～3次，平均(2.15±0.43)次。健康組的年齡為20～33歲，平均(26.79±4.53)歲；分娩孕周為36～40周，平均(38.59±0.81)周；孕次1～3次，平均(2.43±0.46)次；產次1～3次，平均(2.34±0.34)次。兩組一般資料比較差異均無統計學意義(P>0.05)，存在可比性。

1.2 方法

1.2.1 收集臍血和胎盤組織樣本及人胎盤微血管內皮細胞

采集研究組和健康組孕婦晨起空腹靜脈血2mL，待其分娩后立即收集臍血3mL，同時選取1塊(1cm×1cm×0.2cm)靠近臍帶附著位置全層的胎盤組織，將其置于液氮中凍存。

將人胎盤微血管內皮細胞(human placental microvascular endothelial cells，hPMEC)在達爾伯克改良伊格爾培養基(dulbecco′s modified eagle medium，DMEM)(含有10%胎牛血清)中培養，hPMEC細胞置于5%CO2及37℃環境下細胞培養箱中培養，至hPMEC細胞生長到80%～90%融合時需應用胰蛋白酶進行傳代，獲得處于對數生長期進行后續細胞增殖、遷移及小管形成實驗。

1.2.2 實驗材料

2-ME、COMT、Ang-2酶聯免疫吸附試劑盒購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，組織裂解液購自北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司，二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白試劑盒購自上海睿時生物科技有限公司，一抗與二抗購自Bioss公司，增強型化學發光試劑(enhanced chemiluminescence，ECL)顯影劑購自上海李記生物科技有限公司，hPMEC購自中國科學院上海細胞庫，DMEM培養基購自廣州市超博科技有限公司，噻唑藍(thiazolyl blue tetrazolium bromide，MTT)試劑盒購自北京索萊寶公司，Transwell細胞小室購自康寧醫療器械有限公司，Matrigel基質膠購自上海浩然生物技術有限公司。

1.2.3 外周血和臍血及胎盤組織指標的測定

1.2.3.1 外周血和臍血2-ME水平的測定 以1 000r/min離心10min處理標本，獲得上清液，應用酶聯免疫吸附試劑盒測定其水平，對應測定均按照試劑盒說明書中步驟進行操作。

1.2.3.2 胎盤組織COMT水平的測定 采用蛋白印跡法進行測定，取合適的胎盤組織，應用組織裂解液充分降解，以12 000r/min離心5min，獲得上清液，抽提胎盤組織蛋白，應用BCA蛋白試劑盒測定抽提蛋白濃度，隨后應用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)，測定目的蛋白及對應內參蛋白(GAPDH)表達情況，完成SDS-PAGE后蛋白轉移到聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidenedifluoride，PVDF)上，轉移完成后進行洗膜處理，應用5%脫脂奶粉進行封閉。添加一抗后，在4℃環境下進行過夜孵育，第2d洗膜后，添加二抗置于37℃環境下孵育1h。孵育完成再次洗膜，添加ECL顯影劑置于暗室曝光顯影。目的蛋白相對表達量為目的蛋白與內參蛋白條帶灰度值之比。

1.2.4 細胞實驗

1.2.4.1 細胞的處理 取處于對數期hPMEC，采用胰酶進行消化，選擇存在10%胎牛血清DMEM培養液調成1×105/mL細胞懸液，接種至96孔板中，應用無胎牛血清DMEM培養基培養24h，應用5μmol/L、10μmol/L、15μmol/L濃度的2-ME處理培養細胞，作為2-ME處理組，而空白對照組則采用等量培養基處理，各組均設定5個復孔。

1.2.4.2 細胞增殖的測定 對培養細胞應用2-ME處理后，繼續培養24h、48h，各孔均添加為5mg/mL濃度、20μL體積MTT繼續處理6h，6h后將孔內液體吸去，應用酶標儀測定570nm位置吸光度值，最后相對抑制率=(1-2-ME處理組/空白對照組)×100%，最終結果為3次測定的均值。

1.2.4.3 細胞遷移的測定 應用無血清培養基將消化后細胞配置成1×105/mL懸液，以100μL/孔接種到Transwell細胞上室中，下室則需要添加存在10%胎牛血清培養基500μL，培養12h后將其中培養液棄去，補充10%胎牛血清培養基，在37℃環境下培養48h，用棉簽將上層沒有遷移細胞輕輕擦去，應用4%多聚甲醛固定，出現結晶紫顏色后置于100倍鏡下隨機選擇5個視野，計算遷移細胞數目，最終結果為3次測定的均值。

1.2.4.4 小管形成的測定 在培養板底部添加0.3mL的Matrigel基質膠，將其鋪平后，在37℃環境下靜置處理10h，對消化后細胞采用無血清培養基配置成1×105/mL懸液，隨后以100μL/孔密度進行接種，培養12h后將其中培養液棄去，添加存在10%胎牛血清培養基再次培養24h，在倒置顯微鏡下觀察小管的形成。

1.3 觀察指標

觀察研究組和健康組孕婦外周血和臍血2-ME、胎盤組織COMT水平，分析外周血和臍血2-ME、胎盤組織COMT水平的相關性；分析不同濃度2-ME處理對hPMEC細胞增殖、遷移、小管新形成的影響。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 研究組與健康組孕婦外周血和臍血2-ME及胎盤組織COMT水平情況

研究組外周血2-ME水平顯著低于健康組(P<0.05)，研究組與健康組臍血2-ME水平比較差異無統計學意義(P>0.05)；研究組胎盤組織中COMT水平顯著低于健康組(P<0.05)，見表1、圖1。

表1 研究組與健康組外周血和臍血2-ME及胎盤組織COMT水平的比較Table 1 The comparison of 2-ME levels in peripheral blood and cord blood and COMT levels in placental tissue between the two

2.2 外周血和臍血2-ME及胎盤組織COMT間相關性的分析

經Pearson相關性分析顯示，外周血2-ME與臍血2-ME、胎盤組織COMT均呈正相關(P<0.05)，臍血2-ME與胎盤組織COMT呈正相關(P<0.05)，見表2。

表2 外周血2-ME和臍血2-ME及胎盤組織COMT間的相關性Table 2 The correlation among peripheral blood 2-ME,cord blood 2-ME and COMT in placental tissue

2.3 不同濃度2-ME處理組對hPMEC增殖影響的分析

不同濃度2-ME處理組(5、10、15μmol/L)的hPMEC在24h和48h的細胞抑制率均顯著低于空白對照組(F值分別為18.907、18.593，P<0.05)，且隨著2-ME處理濃度的增加，24h和48h的細胞抑制率均逐漸下降(P<0.05)，見表3。

表3 不同濃度2-ME處理組對hPMEC增殖的影響Table 3 The effect of different concentrations of 2-ME on the proliferation of

2.4 不同濃度2-ME處理組對hPMEC遷移和血管內皮細胞小管形成度影響的分析

不同濃度2-ME處理組(5、10、15μmol/L)的hPMEC遷移細胞數目和血管內皮細胞小管形成度均顯著高于空白對照組(F值分別為25.751、42.215，P<0.05)，且隨著2-ME處理濃度的增加，遷移細胞數目和血管內皮細胞小管形成度均逐漸增加(P<0.05)，見表4。

表4 不同濃度2-ME處理組對hPMEC遷移和血管內皮細胞小管形成度的影響Table 4 The effect of different concentrations of 2-ME on hPMEC migration and endothelial cell tubule

3 討論

3.1 2-ME在FGR發生中的作用

FGR是重要的妊娠并發癥之一，在我國FGR發病率為3%～7%，FGR新生兒病死率高于正常新生兒的3～5倍，同時FGR新生兒近期與遠期并發癥發生風險也顯著上升[7]。目前研究認為胎盤血管形成異常所致胎盤血氧缺乏為FGR發生的重要原因，2-ME作為雌二醇重要代謝產物之一，主要通過胎盤COMT甲基化而誘導形成，在促進血管形成、抑制細胞增殖及促進細胞凋亡中發揮著重要作用[8]。本研究中，研究組外周血2-ME水平顯著低于健康組，研究組與健康組臍血2-ME水平比較差異無統計學意義，研究組胎盤組織中COMT水平顯著低于健康組，這些均顯示2-ME及COMT在FGR中發揮重要作用，分析原因認為2-ME在缺氧情況下通過促進血管形成、誘導絨毛滋養細胞增殖等過程改善胎盤血液循環，進而影響胎兒生長[9]。COMT是誘導雌二醇轉化為2-ME的重要降解酶，經由影響錳超氧化物歧化酶水平而使機體缺氧誘導因子1α水平保持穩定，使血管內皮細胞功能損傷，進而誘導FGR發生[10]。本研究中，研究組與健康組臍血2-ME水平差異不大，可能是因為母體2-ME不能有效地穿過胎盤屏障所致。本研究中對外周血和臍血2-ME及胎盤組織COMT間的關系探究顯示，各指標均存在明顯正相關關系，提示三指標可能共同介導了FGR發病，但其具體機制尚需進一步研究證實。

3.2 2-ME在胎盤組織血管內皮功能中的作用

研究顯示雌二醇可以抑制Ang-2所致心血管不良反應，而2-ME作為雌二醇重要代謝產物，在影響心血管病變中發揮著重要作用[11]。另一項體外研究顯示，2-ME通過調節磷脂酰肌醇3-激酶/絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶和核轉錄因子-κB信號通路抑制血管細胞粘附蛋白-1表達，從而阻止單核細胞與血管內皮細胞的粘附，顯示2-ME可以有效改善內皮功能[12]。Zou等[13]應用顱內靜脈高壓大鼠模型及缺氧人臍靜脈內皮細胞進行了體內與體外血管形成誘導實驗，發現經2-ME處理可以有效抑制缺氧導致血管形成，其主要經p53表達上調及ID-1表達下調發揮作用。國外一項對大鼠的動物實驗發現，經2-ME處理可以有效抑制慢性間歇缺氧大鼠肺血管形成，其主要經影響肺動脈平滑肌增殖、活性氧及細胞遷移等過程發揮抑制肺血管形成作用[14]。有研究表明，2-ME可以抑制多種腫瘤細胞增殖，且這種作用顯示為濃度與時間依賴性[15]。多項研究顯示，2-ME對于血管作用具有一定雙面性，其在不同類型疾病中經由不同信號通路影響疾病發生與進展[16-17]。為進一步明確2-ME在胎盤血管形成中的作用，本研究選擇hPMEC進行體外細胞實驗，其結果顯示，經2-ME處理可以有效地促進hPMEC增殖、遷移及血管內皮細胞小管形成，并上調Ang-2分泌，且這一趨勢還會隨著2-ME濃度的增加而加重，表明2-ME可以有效地促進hPMEC血管重塑，其可能經上調Ang-2水平發揮作用，分析原因可能為2-ME通過上調Ang-2水平促進滋養細胞增殖分化，進而促進胎盤血管形成。

綜上所述，FGR患者體內2-ME水平異常，且與胎盤COMT水平變化有關，2-ME可能影響胎盤組織血管內皮功能及血管形成，進而介導FGR發生，其中是否存在其他因素影響尚需進一步研究證實。