中藥中寡糖分離分析方法研究進展

劉妍妍，劉建飛，邢連喜，邸多隆*

1甘肅中醫藥大學藥學院；2中國科學院蘭州化學物理研究所中國科學院西北特色植物資源化學重點實驗室/甘肅省天然藥物重點實驗室，蘭州 730000；3西北大學生命科學學院，西安 710069；4陜西功能食品工程中心有限公司，西安710000

隨著2012年糖科學領域路線圖[1]的繪制，該領域已經成為生命科學的前沿。越來越多的科學家認識到多糖作為生命過程中不可或缺的信息和功能分子，在細胞的生長、分化、發育過程中擔任著關鍵角色。美國功能性糖組學國際聯合會(Consortion of Function Glycomics，CFG)向美國國立衛生研究院匯報其研究成果時指出，動物、植物和微生物中糖鏈結構與功能研究是未來糖生物學研究的重要方向，必將為人類疾病的研究和治療帶來新的希望。2018年由中國海洋大學、中國科學院上海藥物研究所和上海綠谷制藥聯合研發的治療阿爾茨海默癥新藥“甘露寡糖二酸(GV-971)”以其新穎的作用模式與獨特的多靶點作用特征，為阿爾茨海默癥藥物研發開辟了新路徑，并有望引領糖類藥物研發新的浪潮[1]。GV-971的成功研發使人們更加清晰地認識到糖類正在改變人類對生命現象和疾病的認識。糖鏈結構復雜功能多樣，契合復雜疾病治療的標準需求，糖類藥物有望引領治療復雜疾病的創新前沿[2]。寡糖也是糖類研究的一個重要組成部分，寡糖是2～10個相同或不同的單糖通過糖苷鍵連接形成直鏈或支鏈的一類碳水化合物，構成單元主要為五碳或六碳糖，以葡萄糖(glucose)、果糖(fructose)、半乳糖(galactose)、木糖(xylose)、阿拉伯糖(arabinose)和甘露糖(mannose)等最為常見。現代研究表明：寡糖具有降血糖[3,4]、抗創傷后應激障礙[5]、抗腫瘤[6,7]、抗菌[8]、免疫增強[9-11]、調節腸道菌群[12]、抗抑郁[13]、增強造血功能[14]、抗病毒[15]等多種藥理、生理活性。從中藥資源種類多樣性和其潛在的藥理活性而言，中藥寡糖的研究具有重大意義和發展前景。該篇內容綜述了中藥寡糖在提取純化、分離分析、結構鑒定三個方面的研究進展，以期為寡糖的現代藥物研究和臨床應用以及功效產品創制提供科學參考。

1 中藥寡糖提取方法研究進展

寡糖多為水溶性糖，通常采用水提法、水提醇沉法、回流提取法、超聲提取法、微波提取法、酶解法或多種方法聯用的方式來提取。巴戟天低聚糖是一種較為常見的中藥寡糖，一般采用水提法進行提取，但由于中藥提取液中除含有低聚糖外，還含有部分多糖及蛋白質，因此采用水提法需要加入乙醇沉淀多糖；另一種提取方法為回流提取法，利用寡糖易溶于乙醇而多糖、可溶性蛋白質不溶于乙醇的性質，采用乙醇為提取溶劑可得到純度更高的寡糖并簡化操作步驟；采用乙醇提取的另一原因是巴戟天低聚糖在水中不穩定，在不同pH水溶液中提取變化差異較大，低聚糖會被水解或者產生較多新的未知成分，而低聚糖在乙醇體積分數為40%或以上時的溶媒中較為穩定[16]，因此40%乙醇經常被用作巴戟天寡糖的提取溶劑。

Zhou等[17]以95%乙醇為提取溶劑對桂花寡糖進行提取，在最優條件下，桂花寡糖的提取率為90.29%。該方法操作簡便、精密度高，且桂花寡糖的收率穩定。Ma等[18]用水提醇沉法制得4個不同產地的粗黨參低聚糖，經Sephadex G-25純化得到精制的黨參低聚糖，其中山西產黨參提取率為34%、甘肅產黨參1號和素花黨參為16%，四川產黨參為13%。Liu等[19]使用超聲波輔助提取山藥低聚糖，得率提高了3.91%。Norazlina等[20]采用微波輔助法從檸檬草葉片中提取木糖，提取率可達到2.91 g/L。Guo等[21]采用超聲-微波輔助提取法優化了蓮子低聚糖的提取工藝，蓮子低聚糖提取10 min時，最高得率可達10.53%，而用熱水浸提法提取蓮子低聚糖時間為66 min，得率僅為8.09%[22]；Deng等[23]通過酶解來提高瓊膠寡糖水解度，得到新瓊四糖和少量新瓊二糖，還原糖含量為4.652 mg/mL，這說明酶解反應不僅可以得到某一特定聚合度的寡糖，還可通過控制酶解程度，同時得到多個聚合度的寡糖，該工作為功能性瓊膠寡糖的酶解制備和應用提供科學參考。Zhao等[24]探索了酶法和超聲提取法聯用提取靈芝寡糖的最佳工藝，先探索了最佳酶解條件，然后利用超聲處理酶解后的樣液，優化超聲條件，在最佳優化條件下靈芝寡糖最高得率為61.64%，比原料液中提高了1.76%，因此就寡糖產量而言，該方法可以作為寡糖提取的一種有效方案。與巴戟天寡糖相同，石莼可溶性糖粗提液中也夾雜許多的多糖及可溶性蛋白質，Li[25]采用超聲輔助酶法先對寡糖進行提取，對提取液進行濃縮后采用醇沉法去除多糖和蛋白質，得到石莼功能性寡糖，提取率為2.38%。

以上內容表明，寡糖的提取正在從傳統的高料液比、長時間、操作復雜及低效率向低料液比、短時間、操作簡單及多種提取方法的聯用進行轉變，與傳統方法相比，寡糖的提取效率、提取純度也有明顯提高。寡糖提取方法比較見表1。

表1 寡糖提取方法比較

2 中藥寡糖分離方法研究進展

寡糖的分離方法主要有膜分離法、液相色譜法和毛細管電泳法等。寡糖分離方法總結見表2。

表2 寡糖分離方法總結

2.1 膜分離技術

膜分離技術是利用機械篩分的原理選擇性從溶液中分離目標物質的方法，具有不損害樣品生物活性、分離效率高、能耗低、無污染等優點，被廣泛應用于中藥寡糖的分離。Zhao等[26]采用納濾膜NF-3A、NF-2A構建了恒容滲濾方法分離純化大豆低聚糖發酵液，收率可達83.2%，純度可達77.9%。Cai等[27]采用微濾、超濾、納濾膜建立了整合集成膜分離系統，利用該系統從猴頭菌中分離得到粗寡糖，含量為14.84%，純度為63.71%。Nabarlatz等[28]采用商業薄膜聚合超濾膜純化杏仁殼水解得到的低聚木糖，占回收非揮發性產物的58.3%。用膜過濾技術分離寡糖時，要根據目標分離物的分子大小選擇適宜孔徑的濾膜，孔徑大的微濾只是簡單的粗過濾，過濾精度較低；超濾法一般被用來除蛋白質或其他大分子物質，而納濾膜可除去一些小分子糖類。膜分離法分離寡糖收率較高，而且可獲得純度較高的寡糖，但該方法不適合分離分子量相近的寡糖。同時，該技術對設備要求和膜的要求較高，操作復雜，還受到壓力、溫度、時間等多種因素的影響。

2.2 液相色譜法及其聯用技術

液相色譜法是寡糖分離分析應用最廣泛的方法，根據所選色譜柱的不同可具體劃分為凝膠排阻色譜法、親水作用色譜法、陰離子交換色譜法、石墨化碳柱色譜法、反相高效液相色譜法等。

2.2.1 凝膠色譜法(gel chromatography，GFC)

凝膠色譜法是根據被分離化合物的分子大小不同實現分離，分子量小的可以進入材料的孔隙，因此保留時間較長，最后被洗脫出來；而分子量大的化合物則與之恰好相反。凝膠色譜法按照流動相的不同又分為凝膠過濾色譜法(gel filtration chromatography，GFC)和凝膠滲透色譜法(gel permeation chromatography，GPC)。寡糖分離最常用的色譜填料有葡聚糖凝膠G(Sephadex G)、羥丙基葡聚糖凝膠LH-20(Sephadex LH-20)和聚丙烯酰胺凝膠(Bio gel P)。Pan等[29]將采用聚丙烯酰胺凝膠柱從黃精寡糖同系物中分離得到了具有抗病毒作用的聚合度單一的呋喃型直鏈黃精四糖，提示聚丙烯酰胺凝膠Bio Gel P2可以有效分離聚合度1～5的寡糖，并且添加碳酸氫銨可以減少填料的特異性吸附，改善分離性能。Wei等[30]依次采用大孔吸附樹脂柱層析、活性炭柱層析和Sephadex LH-20凝膠柱層析法從黃精低聚糖浸膏部位分離得到純度92.6%，平均相對分子質量為1 471 Da的均一性寡糖。經鑒定該寡糖為單一葡萄糖組成的D-吡喃葡聚糖，分子中葡萄糖主要通過1→3和1→4苷鍵連接，構型多為β-糖苷鍵，也存在少量α-糖苷鍵。Jiang等[31]對猴頭菌醇沉部位采用Sephadex G-25凝膠色譜純化，得到了寡糖Hep-1-3，經檢測其含量為91%，該方法分離效果顯著，但分離時間長，洗脫劑消耗量大。Hao等[32]采用Sephadex G-50凝膠柱層析分離純化，獲得了水溶性的牛蒡寡糖BOS-2，該寡糖含量為98%，分子量為2 134 Da，是一種由葡萄糖和果糖1∶12組成，聚合度為13的菊糖構型的低聚果糖。凝膠色譜法是分離純化寡糖最常用的方法，寡糖經過離子交換柱、大孔樹脂或者活性炭層析柱進行粗分后，采用適宜的凝膠材料對其進行進一步純化，均可得到純度更高的均一性寡糖，而且凝膠柱色譜可根據分子量大小選擇適宜的凝膠填料，洗脫液一般為水，操作簡單。但該色譜材料容易被污染，而且隨著分離時間增加，流速也會減慢。

2.2.2 親水作用色譜法(hydrophilic interaction chromatography，HILIC)

在組成糖鏈的單糖結構中有大量的羥基存在，這使得糖鏈具有較強的親水性。由此研究者們發明了一種以材料表面官能團與糖鏈之間的親水作用為基礎的親水作用色譜法(HILIC)。其中，分離糖類的固定相一般包括化學鍵合的二醇基、氨基、糖基、環糊精、聚乙二醇、嵌入酰胺或者氨基甲酸酯的烷基，以及聚合物鍵合相，如聚琥珀酰亞胺型PolyHydroxyethyl A、PolyCAT A 和PolySulfoethyl A，聚磷酸膽堿型KS-polyMPC等[33-35]。Zhai等[36]開發了一種新型3-氨基苯硼酸功能化二氧化硅固定相，該材料對極性化合物保留率高、選擇性高且具有質譜相容性。同時，硼酸與順式二羥基產生可逆性吸附和解析，因此可特異性分離含有順式二羥基的糖類化合物。用于親水作用液相色譜時，新型3-氨基苯硼酸功能化二氧化硅固定相在分離殼寡糖方面表現出很好的HILIC特性，其分配和吸附雙模式組合機制，為糖類的分離分析提供了新的思路[37]。Yang[38]采用高效液相色譜法對比了巴戟天根頭、根中、根尖這3個部位寡糖的分布規律，發現10株巴戟天相同部位中耐斯糖平均含量分別為45.76、59.31、65.04 mg/g。Liang[39]采用固相萃取(stationary phase extraction，SPE)下的HILIC模式對澤蘭提取物進行分離，采用Click TE-Cys(100 mm×4.6 mm.id)色譜柱，分離出了蔗糖、棉籽糖、水蘇糖、毛蕊花糖和筋骨草糖。該方法使得低豐度的寡糖得到了有效富集，大幅度降低了洗脫餾分的復雜程度，還可除去單糖、蔗糖及其他非寡糖類化合物，在上樣后可直接采用70%乙腈洗脫以達到純化寡糖的目的。

Yuan等[40]利用低共熔溶劑作為硅烷化和自由基鏈轉移聚合反應介質，可控制備了一種葡萄糖量子點鍵合硅膠親水色譜固定相，該固定相對糖基化合物等極性分析物具有較好的保留能力和分離選擇性，并成功用于枸杞樣品中果糖和葡萄糖含量測定，結果顯示果糖濃度為3.4 mg/mL，葡萄糖濃度為2.2 mg/mL。碳量子點修飾的液相色譜固定相以其獨特的優勢為糖類的分離提供了一個更優選擇。Yang等[41]制備了一種基于巰基-烯烴點擊化學的聚丙烯酰胺型親水作用色譜，成功將β-1,4-低聚半乳糖分離為DP 2～7的6個峰，分離度高，峰形良好。這一研究結構表明TE-UPAM固定相可以被很好地應用到極性化合物的分離當中。Fu等[42]發現中性糖類化合物在麥芽糖色譜柱上的具有典型的HILIC特點，同時采用頂替吸附-液相相互作用模型對糖類化合物的保留行為進行定量描述，并將保留公式，通過優化梯度的半制備HILIC進一步純化了地黃洗脫液，得到了15個以上的峰，通過重復進樣獲得了毫克級化合物。Jiang等[43]考察了松三糖、棉子糖在兩性離子親水作用色譜柱Click TE-Cys上的色譜保留行為，在流動相為70%乙腈時，單糖、二糖、三糖按照極性由小到大依次被洗脫。這說明糖類化合物的極性越大，保留時間則越長。這可能是由于HILIC流動相中水相比例的降低，緩沖鹽轉移到了水相中，增加了其極性和厚度，使得溶質在水相中的分配系數增大，因此保留時間延長[44,45]。作者結合該數據建立了糖在Click TE-Cys色譜柱上的保留行為回歸方程，該結果有助于親水作用色譜材料的系統評價和評價方法的建立。Wang等[46]利用物理涂敷的方法將親水聚合物以凝膠方式層層組裝于硅膠表面，成功制備了一種親水性色譜新材料。色譜性能評價表明:該材料表現出典型的親水色譜分離機理，親水分離范圍很寬(乙腈體積75%～95%)，其最高柱效能達到168 133 塔板/米。考察了該固定相對10種糖標準品(D-核糖、木糖、阿拉伯糖、棉子糖、葡萄糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖、肉蓯蓉糖和果糖)的分離效果，發現10種糖按照極性在3層PAM-Sil固定相中完全分離。此外，對果糖和葡萄糖等異構體也可分離；由此說明PAM-Sil固定相對于大極性化合物具有更好的分離選擇性。Fu等[47]采用二乙烯基砜活化化學方法制備了以谷胱甘肽為親水性基團的硅基HILIC材料(命名為SiO2-DVS-GSH)。在HILIC模式下，用寡糖對新材料的分離性能進行了評價。以低聚果糖為研究對象，色譜分析結果表明低聚果糖的聚合度(DP)在2～26之間，分離良好，峰形良好。由于HILIC模式的主要保留機制是分析物在流動相和HILIC固定相上的“富水層”之間的分配相互作用[48]，隨著DP的增加，分析物與SiO2-DVS-GSH表面“富水層”之間的相互作用增強；因此，可以對DP較高的低聚果糖進行洗脫。

賓陽縣大陸村以古辣香米產業特色與美麗宜居鄉村建設相結合，以成熟的產業鏈和標準化的生產，實現產村互動，農旅結合，把大陸村打造成“稻花鄉里”示范村。農旅融合是未來鄉村旅游發展的方向，是農民增收的一個重大支撐點。2016年啟動了廣西賓陽萬頃香米產業示范區項目，該項目是自治區政府扶持賓陽縣重點打造的15萬畝涉優質香米種植示范區，并計劃在3到5年內建設成為自治區級水稻種植產業示范區和自治區級休閑農業和鄉村旅游示范區，同時該項目也是目前賓陽縣最大的規劃農業與旅游融合、統籌城鄉發展的項目。

HILIC是以極性固定相和水溶性有機溶劑為流動相對極性化合物(如糖類)進行分離的一種方法，具有正相色譜和反相色譜完全不同的分離特性。HILIC的固定相上鍵合的基團不同，其保留機制也會有所不同。隨著固定相種類的增多，HILIC也得到了快速發展，在極性化合物的分離中應用廣泛并具有顯著的優勢，比如可以分離含有復雜糖鏈的糖類化合物，在分離聚合度較高的寡糖時也具有很高的分辨率。根據以上內容我們不難看出，親水色譜材料種類豐富，在糖類化合物的分離分析中存在很大的潛力，可以為寡糖的分離提供更多、更優的選擇。

2.2.3 離子交換色譜法(ion-exchange chromatography，IEC)

離子交換色譜法是以離子交換劑為固定相、利用被分離組分與固定相之間發生離子交換能力的差異而實現分離的一種液相色譜分離技術。離子交換色譜固定相上的離子基團可與待分離組分的某種基團結合，當用流動相洗脫時，寡糖按照結合能力從小到大的順序依次被洗脫下來，而達到分離的目的。離子交換色譜法具有樣品用量少、分離效率高、靈敏度高的優點，適用于在高pH的流動相下，分離酸性寡糖，但是其定性能力差，可與其他色譜法聯用提高分離純化效果。高效離子交換色譜-脈沖安培檢測法(high performance anion exchange chromatography-pulsed amperometric detection，HPAEC-PAD)，固定相一般為離子交換樹脂，通常與脈沖安培檢測器(pulsed amperometric detection，PAD)聯用，待測組分生成的離子隨著流動相通過離子交換樹脂，與樹脂中可交換的離子基團發生離子交換，形成離子交換平衡，從而在流動相與固定相之間形成分配來實現分離。

Qiu等[49]采用陽離子樹脂-陰離子樹脂-活性炭聯用的方法，以10%乙醇溶液進行洗脫，分離得到水蘇糖，該方法的研究有效地解決了從地黃中直接分離制備單體難度大、制備繁瑣、單體純度低等問題，得到了純度較高的四糖(水蘇糖)單體，該實驗為制備地黃寡糖中各個單體提供了一定的研究基礎。Ballance等[50]選用半制備離子型Pac-AS4A柱分離酸水解得到的褐藻膠寡糖，得到聚合度為5的寡糖，寡糖的純度為96%。Li等[51]采用Pharmacia柱分離酶解法制備的褐藻膠寡糖，得到包括二糖和三糖的6種寡糖。Peng等[52]采用TSK-GEL-DEAE-2SW柱分離褐藻膠寡糖混合物，分離得到12個褐藻膠寡糖組分，各組分的純度均高于97%。Hu等[53]采用DEAE Sepharose Fast Flow陰離子交換柱層析對木耳寡糖進行分離純化，該色譜柱主要功能是脫蛋白作用，其脫蛋白率可以達到96%，是一種理想的分離純化方法。

Ma等[54]采用HPAEC-PAD對巴戟天中的蔗糖、1-蔗果三糖、耐斯糖、1F-果呋喃糖基耐斯糖進行了檢測，這4種寡糖分離度良好。該實驗中采用了Hamilton RCX-10色譜柱(4.1 mm×250 mm，7 μm)，填料為PS-DVB/三甲基銨交換樹脂，交換容量可達到0.35 meq/mg，遠遠大于PRP-X100，可用于等度和梯度洗脫碳水化合物；對聚合度小于3的碳水化合物可以快速實現等度分離；基于堿性條件下不同糖類化合物會帶不同的電荷，針對復雜樣品進行梯度洗脫時，可通過調節流動相的濃度來分離各種糖類化合物。Alyassin等[55]使用CarboPac PA200色譜柱對16種濃度均為20 mg/mL糖的標準品混合物進行了分析，采用NaOH和CH3COONa水溶液梯度洗脫的HPAEC-PAD方法，可以在CarboPac PA200柱上同時分離16種標準的單糖、低聚木糖、阿拉伯低聚糖和糖醛酸，發現采用梯度洗脫可實現較高的分離度。CarboPac PA200為陰離子交換柱，無需衍生，可實現快速、重復分離；填充材料為疏水性聚合物薄殼型陰離子交換樹脂，在pH 0～14范圍內保持穩定，同時，堿性水溶液的線性梯度洗脫不僅提高了寡糖色譜柱的分離性，而且提高了分離度，且這種洗脫液有利于糖類在金電極上的陽極氧化，在較長時間下仍可有效分離低聚糖。Chen等[56]采用HPAEC-PAD對DP為2～6的5種殼寡糖標準樣品進行分離和檢測，建立殼寡糖的保留因子與聚合度的關系，根據建立的相關關系對未知的殼寡糖進行定性分析。結果表明，殼寡糖聚合度的對數值與其保留因子的對數值具有線性關系，利用線性回歸方程對鑒定出樣品中的4種未知殼寡糖分別為殼七糖、殼八糖、殼九糖和殼十糖,且測量誤差≤5.66%。

2.2.4 石墨化碳色譜法(graphitized carbon chromatography，GCC)

石墨化碳液相色譜是一種常用于分離寡糖和糖結合物的分離方法，石墨化碳材料對寡糖具有良好的保留和分離選擇性,尤其適用于寡糖異構體的分離，并且石墨化碳柱容量大，適合寡糖的制備性分離[57]。與糖類HPLC分析中常用的正相、反相和陰離子交換柱的分離原理不同，GCC的保留機制為填充劑和樣品疏水相，電子供、受體之間的相互作用；分離機制與化合物分子空間結構和分子極性密切相關，化合物分子與石墨化碳結合越緊密，在色譜柱上的保留越強。Harrison等[58]通過聯用GCC和線性離子阱質譜，將13C標記的蔗糖和蔗果三糖作為底物，通過2種酶催化合成果聚糖，結合其二級與三級質譜的碎裂模式，建立了分離和鑒定果聚糖異構體的液相色譜-質譜(LC-MSn)方法。Fu等[59]為了降低樣品的復雜性，增加低聚糖含量，對地黃粗提物進行了石墨化碳固相萃取處理。先用5%、10%、15%的乙腈處理石墨化碳，再用50%的乙腈(含0.1%甲酸)洗脫，由于單糖不保留在石墨化碳柱上，因此用水即可去除粗提樣品中的單糖和大部分非寡糖類化合物，使高純度地黃寡糖得到有效富集。

2.2.5 反相液相色譜法(reversed-phase liquid chromatography，RPLC)

2.2.6 快速蛋白質液相色譜-示差折光檢測法(fast protein liquid chromatography-refractive index detection，FPLC-RID)

FPLC-RID自動化程度高、分離效率高、無需化學試劑即可監測碳水化合物的分離，相比傳統的FPLC，可用來檢測沒有紫外吸收的化合物，該方法擴大了糖類化合物的檢測范圍。Zong等[62]使用FPLC在0.2、0.3、0.4、0.5 mL這4個流速下對聚合度3～5的寡糖進行了純化，在最佳分離條件下，DP 3～5的低聚糖得率分別為1.72、7.52、0.51%。該方法可快速、高效、自動地為地黃及其制品中寡糖RFOs的定性、定量分析提供依據。

2.3 毛細管電泳法(capillary electrophoresis，CE)

毛細管電泳法是一類以毛細管為分離通道，以高壓直流電場為驅動力的分離技術，具備快速、高效、高靈敏度、分離效率高、樣品與溶劑消耗量少等優勢，在糖類分析中得到較好的應用。毛細管區帶電泳(capillary zone electrophoresis，CZE)是CE最簡便，應用最廣泛的分離模式，但是該模式只適合于分離硫酸化、乙酰化和磷酸化等點電荷的糖類。對于中性寡糖，由于其不帶電荷，無熒光基團或發色基團，CE分離分析這些寡糖時常需衍生化或形成絡合物使之帶上熒光基團、發色基團或電荷。

Guo等[63]采用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)對板藍根多糖進行衍生化，通過HPCE分離分析，結果表明電泳作用可以使板藍根寡糖組分按照分子量大小進行分離。該技術可以在短時間內很好地分離低聚糖，操作簡單高效；樣品制備采用熒光發色團標記低聚糖，以此來排除非還原糖[64]。對于不帶電荷的糖類除了上述方法以外，也可以使用含硼酸根的化合物與糖絡合帶電或者使其在強堿條件下電離。糖的羥基具有酸性，可在強堿條件下解離，其中，還原糖半縮醛上的羥基酸性最強，相對其他位置的羥基更容易解離。Yang和Guo等[65,66]對比在酸性與堿性緩沖液條件下北沙參和南沙參水解的寡糖片段的分離效果，結果表明，在酸性條件下，結構相似的寡糖分離度較低，而堿性條件可促進糖與硼酸根絡合，結構相似的寡糖能被更有效地分離，最終所得圖譜更具特征性，且堿性環境下電滲流增加，縮短了分析檢測時間。pH升高可增加電泳分離度，但強堿條件下糖會發生差向異構化和降解反應[67]，會導致基線漂移和峰形變差[68]，因此要控制pH在合理范圍內。由于糖在堿性條件下帶負電，采用CE進行陰離子分析時，也可以加入陽離子表面活性劑作為電滲流改性劑，用來改變電滲流的方向并提高樣品的分離度。

3 中藥寡糖結構分析方法研究進展

3.1 紫外光譜法(ultraviolet spectroscopy，UV)

UV主要用于判斷寡糖中是否含有紫外吸收基團，但寡糖的紫外吸收通常較弱，因此，利用UV法進行寡糖含量測定時，需要將寡糖轉變為糖醛酸衍生物。UV測定的是寡糖經過無機酸水解脫水產生的糠醛(戊糖)或糠醛衍生物(如羥甲基糠醛)與酚類化合物縮合生成的有色物質。Wu等[69]用3,5-二硝基水楊酸(DNS)作為顯色劑，通過斑點顯色情況判斷寡糖的有無和種類，另外，展開劑的種類、配比、展開條件的不同都會對分析結果產生影響，該方法操作簡便，結果直觀，也較為常用，經常被用來做定性分析。

3.2 紅外光譜法(infrared spectroscopy，IR)

紅外光譜在寡糖的結構分析中主要用于官能團以及糖苷鍵構型的確定。寡糖的紅外圖譜主要特征峰有：3 300 cm-1處的一個強寬峰，對應-OH的伸縮振動，在2 936 cm-1附近有一個弱的伸縮帶，對應-CH單鍵的伸縮振動；1 740 cm-1處的吸收峰代表糖醛酸的存在；1 640 cm-1和1 100 cm-1的吸收峰表示分別對應 C=O和C-O的伸縮振動；在1 400 cm-1左右的吸收表示-CH的彎曲振動；1 200～1 000 cm-1區域的強吸收代表C-O-C糖苷鍵的存在，C-C和C-OH鍵的伸縮振動，1 024 cm-1附近的吸收峰對應于寡糖的一個吡喃糖單元；930 cm-1和820 cm-1附近的典型吸收峰表明存在β型和α型糖苷鍵的呋喃糖環[70]。

3.3 氣相色譜-質譜法(gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)

氣相色譜是鑒定寡糖糖苷鏈連接方式的主要手段之一。Bai等[71]采用氣相色譜法對水提醇沉得到的黨參寡糖進行了結構分析，將黨參寡糖在120 ℃下用2 mol三氟乙酸(trifluoroacetic Acid，TFA)直接水解2 h，除去TFA之后，水解產物轉化為糖醇乙酸酯后進行氣相色譜分析。GC-MS分析結果表明，黨參寡糖的主要單糖組成為果糖和葡萄糖(α-Glcp、β-Glcp、β-Fruf、β-Fru)，摩爾比為1.21∶1，對寡糖甲基化衍生后采用GC-MS進行分析，糖苷鍵連結方式為→1-α-D-Glcp,→2)-β-D-Fruf-1(→和β-D-Fruf-(2→。

3.4 高效薄層色譜法(high performance thin-layer chromatography，HPTLC)

Zhou等[72]采用HPTLC對巴戟天水提液中的成分進行定性分析，確定巴戟天藥材及其產品中的3種寡糖分別為耐斯糖、1F-果呋喃基耐斯糖、蔗果三糖；通過對比顯色劑苯胺-二苯胺-磷酸和苯胺-鄰苯二甲酸的顯色效果，發現只有在α-萘酚-硫酸做顯色劑時，顯色反應靈敏，斑點清晰，而且容易控制。因此，在該實驗中將α-萘酚-硫酸作為顯色劑。

3.5 質譜法(mass spectrometry，MS)

MS技術是寡糖結構分析最常用的方法，早期主要利用GC-MS來分析糖類的組成和連接方式，隨著電離技術的發展，電子轟擊質譜(EI-MS)、快原子轟擊質譜(FAB-MS)、基質輔助激光解吸-飛行時間質譜(MALDI-TOF MS)、電噴霧-質譜(electron spray ionization-mass spectrometry，ESI-MS)等軟電離技術的發展，對于寡糖的分子量和糖殘基的連接順序的研究起到了很大的推動作用。一般用來測定大分子量寡糖的是MALDI-TOF MS和ESI-MS，其中MALDI-TOF MS測量的分子量能夠達到100 000 Da。ESI-MS作為一種軟電離技術，可獲得多電荷的分子離子[M+nH]n+或[M-nH]n-，擴大可測定的分子量范圍，對寡糖分子量和單糖組成種類進行分析可進一步推斷寡糖的聚合度；在ESI-MSn中寡糖發生糖苷鍵斷裂的機理為，未衍生的寡糖在斷裂過程中發生質子轉移，斷裂后形成的不飽和六元環容易發生跨環裂解，產生具有表征其結構信息的特征碎片[73]。寡糖的連接鍵構型、連接順序可通過ESI-MS的二級碎片結構得到，二者的聯合應用也使得寡糖的定性定量分析更加快捷高效。因其所具有的高靈敏度、高精確度和快速定性等特點，ESI-MS已成為寡糖結構分析的重要技術之一。Luo等[74]對純化的銀耳寡糖TPH-1還原末端采用PMP進行衍生，ESI-MS分析結果顯示，質荷比m/z687.1處為二糖連接兩分子PMP的分子離子峰，應為[Glc A-Man-(PMP)2]的分子離子峰；m/z510.9處為甘露糖連接兩分子PMP，應為[Man-(PMP)2]的分子離子峰。說明TPH-1為分子量356 Da的二糖，二糖的還原末端為Man，非還原末端為Glc A。Pu等[75]基于UPLC-QTOF MS(負離子模式)推斷出了遠志中的6個蔗糖酯類化合物和15個低聚糖酯類化合物，通過產生的分子離子峰、丟失基團以及碎片離子的質荷比，判斷該化合物為阿魏酸與蔗糖成酯接連而成。Zhang等[76]以NaOH為填料制備固相甲基化柱，以CH3I為甲基化試劑，采用超高效液相色譜-三重四極桿質譜聯用結合固相甲基化技術對不同生長環境人參中寡糖的甲基化產物進行了測定，通過對比與寡糖對照品相對保留時間和質譜碎片信息，證明人參中存在6種還原寡糖(麥芽糖、麥芽三糖、麥芽四糖、麥芽五糖、麥芽六糖、麥芽七糖)和3種非還原寡糖(蔗糖、蔗果三糖、蔗果四糖)，而且該方法可以同時測定人參中9種寡糖的含量，為人參中寡糖的分布提供了測定方法。Luan等[77]采用FAB-MS對比了遠志生品、蜜炙遠志、甘草制遠志、清水煮遠志、遠志木心中黃花遠志素A、遠志蔗糖酯A和遠志蔗糖酯C的含量。實驗結果表明遠志寡糖酯類成分性質不穩定，在炮制過程中酯鍵發生了水解，與前期研究中遠志甘草汁煮制后多種寡糖酯類成分和遠志皂苷B含量降低，小分子有機酸含量增加的結論相吻合。Li等[78]對水提醇沉得到的人參低聚糖進行過甲基化處理，分離并鑒定出了12種低聚糖，采用UHPLC-Q-Orbitrap/MS對低聚糖進行了結構分析，其中Erlose為人參中首次報道的非還原性低聚糖，首次鑒定出了麥芽糖、蔗糖、麥芽糖三糖、丙酮和聶氏糖5種低聚糖。[M+NH4]+和[M+Na]+分別在m/z676.38和681.33有高強度的離子峰，[M+H]+在659.35處有低強度離子峰；低聚糖[M+Na]+的數據也為人參結構鑒定提供了更多的結構信息片段。

3.6 核磁共振波譜法(nuclear magnetic resonance spectroscopy，NMR)

核磁共振(NMR)技術發展至今已經較為成熟，是糖類結構解析的重要方法之一，可判斷糖類化合物的種類、糖與糖的連接位置、糖殘基數目、糖苷鍵構型、糖與糖的連接順序等[79]。NMR不需標準品即可進行定性分析，因此特別適用于分析結構未知的糖類，但待測組分必須是高純度且重量在毫克級以上的化合物，且對化合物定性前，目標化合物需要進行分離純化。糖類化合物的NMR圖譜可選用四甲基硅烷或丙酮作為參比標準，測定溶劑多為重水(D2O)，在氘代吡啶、氘代二甲亞砜等非質子溶劑中，糖類化合物的譜圖分辨率較好。NMR技術是糖類化合物結構研究的重要方法之一，該技術的應用可使糖類化學結構的研究更加準確高效，以便于更好地揭示糖類物質的作用機制以及生物活性。Xiao等[80]將從竹子中分離得到的木糖寡糖采用NMR進行結構表征，取15 mg木糖寡糖樣品進行成分分析，結果表明竹粉中木糖含量為18.2%、阿拉伯糖、半乳糖含量分別為0.8%、0.2%，甘露糖、葡萄糖醛酸的含量均為0.1%。經過自動水解后，低聚糖含量為56.6%。Wang等[81]通過DEAE-Cellulose 52和Sephacryls-100過濾柱從牛膝提取液種連續分離得到一種新型寡糖ABW90-1，并通過單糖分析、甲基化分析、IR和NMR等手段對其進行了表征。該寡糖由(2→6)-β-D-呋喃果糖(Fruf)和2→1)-β-D-Fruf殘基組成，末端為Glc和Fru殘基。寡糖結構解析方法比較見表3。

表3 寡糖結構解析方法比較

4 總結展望

本文綜述了中藥寡糖的提取分離，純化以及結構表征方面的研究進展。

寡糖在提取時，應該考慮溶劑對目標寡糖組分的溶解性，寡糖在提取溶劑中的穩定性，寡糖得率，寡糖純度，提取時間，溶劑用量，溶劑環保性和安全性，所采用的設備是否方便操作等因素。目前，寡糖的提取溶劑較為常見的是水和乙醇-水溶液，采用水作為提取溶劑時，一部分多糖和蛋白質也會一起提取出來，給分離和純化帶來了一定難度，另外一些寡糖在水溶液也不穩定。因此，寡糖提取的另一種溶劑為乙醇-水溶液，但該方法的缺點是乙醇消耗量較大，而且對于藥品的提取溶劑來說，并不是一種理想的溶劑。由此可見，目前對于寡糖來說，其提取溶劑的種類還是存在局限性，亟需發現新的溶劑系統，以適應不同種類寡糖的提取要求，在探索新的提取方法的同時，以高品質目標寡糖的得率為目標，將傳統方法與新方法、新設備的優勢進行結合，探索出一種綠色、經濟、高效的提取方法。

寡糖的分離方法主要有膜分離法、液相色譜法和毛細管電泳法等。常規膜分離技術有微濾、超濾、納濾、反滲析，以及結合電化學技術的電滲析、連續電除鹽等。膜分離法分離效率高、能耗低、無污染，可實現分子級過濾過濾過程簡單、易于控制，兼有分離、濃縮、純化和精制的功能，在化合物分離純化除雜方面具有自身獨特的優勢，缺點是該技術對設備要求和膜的要求較高，操作復雜，還受到壓力、溫度、時間等多種因素的影響。新型膜分離技術對膜的工作性能，膜通量、減輕膜污染、降低壓力驅動消耗，甚至降低成本，簡化膜的制造技術，延長單個膜的使用時間都提出了更高的要求。目前新型膜分離技術也已經產生，包括滲透汽化膜、液膜和動態膜等。柱色譜法在寡糖分離純化方面應用極為廣泛，根據分離材料、流動相、分離原理等不同，又分為凝膠排阻色譜法、親水作用色譜法、陰離子交換色譜法、石墨化碳柱色譜法、反相高效液相色譜法等。該方法的重點是分離材料，可以根據寡糖的性質選擇合適的分離材料，以達到最佳的分離純化效果，而且目前糖類化合物的分離材料一直是研究的熱點，在天然產物應用方面也已經較為成熟，因此寡糖的分離純化會變得更加快捷高效，且具有更多的選擇性。電泳法分離寡糖可采用柱前衍生，不經衍生的直接和間接紫外檢測，激光誘導熒光檢測，電極脈沖安培檢測這四種方法，此外，間接紫外檢測還可以對無法衍生化的非還原性寡糖及醛糖酸進行鑒定。目前CE在藥物分析方面仍然具有特色和優勢，并顯示出較大的發展空間，但是仍舊存在多個重要瓶頸問題比如靈敏度、重復性、定性能力等等，這些問題也亟需改進和突破。

寡糖的結構鑒定一般采用紫外和薄層色譜可對具有熒光或可以顯色的糖類進行簡單定性，紅外吸收光譜法主要鑒定寡糖中糖環骨架和官能團，一般用于寡糖結構的初步表征；質譜法一般用于測定寡糖糖鏈和分子量，是寡糖結構鑒定的重要方法之一；核磁共振波譜法是利用特定的原子核在給定的磁場中，只吸收特定射頻輻射形成核磁共振信號，從而進行結構鑒定，通過糖殘基中各位點元素的化學位移產生的信號可以獲得寡糖的結構信息，通過信號峰面積的積分可得到殘基的相對含量。寡糖的純度、分子量及其連接位置、連結方式等特征可以通過GC、MS、NMR以及各種方法聯用來進行測定。寡糖糖鏈具有復雜性和多樣性，以上測定方法對多糖的性質、純度、或用量等方面存在一定要求，也正是由于各種結構表征方法存在的種種限制，因此未來發展趨勢一定是多種方法聯合應用，寡糖的分離分析也是如此，因此寡糖的提取方法、分離技術和結構表征方法的不斷發展，對其寡糖的開發及應用有著深遠的意義。合理可行的方案一定可以實現寡糖高效制備、快速分離和精準表征，使得中藥中的寡糖在食品、醫藥等領域發揮更加重要的作用。