山香圓葉揮發油化學成分及抗氧化和抗炎活性研究

劉 昭，李 利，湯楊黔南，林麗美，夏伯候*

1湖南中醫藥大學，長沙 410208；2湖南省中醫藥研究院，長沙 410013

山香圓葉(別名兩指劍、千打錘、七寸釘)為省沽油科植物山香圓(TurpiniaargutaSeem)的干燥葉[1]。其主要分布于我國的江西、福建、湖南、廣東、海南、廣西、四川、貴州等地。山香圓葉性味苦，寒；歸肺、肝經，具有清熱解毒、利咽消腫、活血止痛的功效，對于咽喉、扁桃體、上呼吸道等炎癥或膿腫性疾病具有快速、高效的作用[2,3]。目前，山香圓葉的藥理研究主要集中在抗炎、抗菌、抗氧化、鎮痛以及增強免疫等方面。基于以上活性，從山香圓葉中發現了100個以上的化學成分，包括黃酮、三萜、酚酸、大柱烷、鞣質、生物堿等多種中等極性以上的物質[4,5]，其中，黃酮是研究最為廣泛的成分，也是藥理活性最多的成分，然而，較少的研究探討其中小極性物質(如精油)的活性及化學成分，限制了對其進一步的開發和應用。因此，探明山香圓葉中小極性物質的化學成分及可能的生物活性，對于其深入的藥用價值的開發具有較好的參考意義。

揮發油又稱精油，大部分具有香氣，如薄荷油、丁香油等，其在醫藥領域具有重要作用，其可治療例如前列腺癌[6]、乳腺癌[7,8]、肺癌[9]等癌癥，并且具有作為抑菌劑、抗氧化劑、抗病毒藥物和皮膚滲透增強劑的潛能。因揮發油的獲取方式相對其他中大極性物質而言具有提取簡單，提取過程環保等優點，其具有更大的開發前景和藥用價值。

因此，本研究首先應用超臨界萃取法提取山香圓葉揮發油等中小極性物質；再分別用GC-MS法和LC-MS法全面表征其小極性揮發性物質和中等極性物質，并鑒定其結構。最后，通過基于體外的抗氧化和細胞抗炎實驗，探討其可能的生物活性，旨在挖掘山香圓葉更廣泛的藥用價值，同時為資源的合理利用提供新思路和新方向。

1 材料與方法

多功能粉碎機(浙江江景天工貿有限公司);SQF電子天平(賽多利斯科學儀器(北京)有限公司);超臨界流體CO2萃取裝置(杭州華賽泵業有限公司);單四級桿氣質聯用色譜儀(GCMS-QP2020，島津);超高效液相色譜(1290UPHLC，Agilent);高分辨質譜(Q Exactive Foucus，Thermo Fisher Scientific);多功能酶標儀(Multiskan MK3，Thermo公司);CO2培養箱(SHEL-LAB，Sheldon Manufactring inc)。

山香圓葉購自湖南省長沙市高橋藥材市場，經湖南中醫藥大學龔力民副教授鑒定為省沽油科植物山香圓(TurpiniaargutaSeem)的干燥葉[1]；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH，Sigma公司，批號：10207 0402)；Vc(Sigma-Aldrich公司，批號：101911771)；ABTS法總抗氧化能力檢測試劑盒(碧云天生物技術有限公司，批號：070319191112)；小鼠巨噬細胞RAW 264.7(中國科學院上海細胞庫)；MTT(Sigma公司，批號：1003010349)；DMEM高糖培養基(美國Hyclone，批號：SH30022.01B)；胎牛血清(美國Hyclone，批號：27250-018)；LPS(Sigma公司，批號：12171104)；陽性藥物地塞米松(DXMS，北京索萊寶科技有限公司，批號：D8040)；小鼠IL-6 ELISA試劑盒(武漢貝茵萊生物科技有限公司，批號：MU30044)；NO Griess試劑盒(碧云天生物技術研究所，批號：202003)。

1.1 揮發油的提取

山香圓葉藥材在50 ℃下烘干后打粉，過60目篩，取629 g山香圓葉藥粉置于萃取釜中。具體操作條件為：萃取釜壓力為25 MPa(溫度45 ℃)；分離釜Ⅰ和分離釜Ⅱ壓力均為5 MPa；溫度分別為50 ℃、55 ℃，CO2流量為24 L/h；萃取時間為3 h。提取完成后于6 000 r/min，4 ℃條件下離心5 min，即得到山香圓葉的揮發油成分。

1.2 GC-MS分析

GC-MS條件：色譜柱為Rtx-5 MS(30 m×250 μm，0.25 μm)，進樣口溫度條件為270 ℃，分流比為20∶1，載氣為He(76 mL/min)壓力為57.4 kPa，程序升溫條件為：初始溫度為120 ℃，保留2 min；以15 ℃/min的速度升溫至180 ℃后再以10 ℃/min升至220 ℃，保持1 min；以2 ℃/min升至224 ℃；以1 ℃/min升至232 ℃；以2 ℃/min升至240 ℃，保持1 min后再以3 ℃/min速度升至243 ℃；以1 ℃/min升至249 ℃；以3 ℃/min升至288 ℃；最后以1 ℃/min升至300 ℃，保持10 min。EI離子源，離子源溫度為200 ℃，接口溫度為280 ℃，溶劑延遲時間5 min，掃描寬度為0～0.2 kV。

甲酯化前處理：稱取200 mg山香圓葉揮發油加入2 mL 2 mol/L的KOH-CH3OH溶液，再加入10 mL正庚烷，在渦旋震蕩儀中混勻后靜置分層。取上清液過2.2 μm的微孔濾膜后再裝入進樣瓶中以備GC-MS檢測。

甲酯化GC-MS條件：氣相色譜柱為Rtx-5 MS(30 m×250 μm，0.25 μm)，進樣口溫度條件為270 ℃，分流比為40∶1，載氣為He(76 mL/min)，柱流速為0.83 mL/min，平均線為33.9 cm/sec。程序升溫條件為：初始溫度為100 ℃，保留2 min后以10 ℃/min的速度升溫至205 ℃后再以3 ℃/min升至227 ℃，然后再以5 ℃/min升溫至265 ℃，最后以3 ℃/min升至300 ℃保持10 min。EI離子源，離子源溫度為200 ℃，接口溫度為280 ℃，溶劑延遲時間5 min，掃描寬度為0～0.2 kV。

1.3 LC-MS分析

LC-MS分析條件：色譜柱為BEH C18色譜柱(1.7 μm×2.1×100 mm)；流動相為0.1%甲酸水溶液(A)-0.1%甲酸乙腈溶液(B)，采用多步線性梯度洗脫：0～3.5 min，95%→85% A；3.5～6 min，85%→70% A；6～6.5 min，70% A；6.5～12 min，70%→30% A；12～12.5 min，30% A；12.5～18 min，30%→0% A；18～25 min，0% A；25～26 min，0%→95% A；26～30 min，95% A。進樣體積為5 μL；毛細管溫度：400 ℃；掃描質量范圍為m/z100～1 500；鞘氣流速：45 Arb，輔助氣流速：15 Ar；Full ms分辨率：70 000，MS/MS分辨率：17 500；碰撞能量：15/30/45 V；噴涂電壓：4.0 kV(正)或-3.6 kV(負)。

通過FullScan-ddMS2功能進行一級、二級質譜數據采集。將獲得的質譜原始數據基于自建數據庫MWDB(Metware Database)及代謝物信息公共數據庫對物質進行篩選和鑒定。所有化合物的二級MS匹配率均在80%以上。

1.4 山香圓葉揮發油的抗氧化活性檢測

在藥物的體外抗氧化實驗中，常用DPPH法進行中藥提取物抗氧化能力的檢測[10]，用ABTS法進行植物源單體和粗體物的總抗氧化能力的檢測[11]。

準確稱取山香圓葉揮發油100.00 mg樣品置于10 mL容量瓶中，用DMSO溶液定容至刻度線得到濃度為10 mg/mL的樣品溶液，再將其分別稀釋到6、4、2、1、0.5、0.25 mg/mL。

準確稱取5 mg的DPPH試劑置于50 mL容量瓶中用DMSO定容至刻度線，將其混勻，在避光處保存。按照試劑盒說明書操作規程分別測定不同濃度樣品的清除DPPH和ABTS能力。

1.5 抗炎活性測定

將培養有小鼠腹腔巨噬細胞株RAW 264.7的高糖DMEM培養基(含10%胎牛血清)，置于37 ℃、5% CO2恒溫培養箱中培養。利用MTT法測定藥物對RAW 264.7細胞活性影響，將培養的細胞分為空白對照組；模型組(加入終濃度為1 μg/mL的LPS)；DMSO組(0.2%)；DXMS組(50 μg/mL)；山香圓葉低、中、高劑量組(濃度分別為30、40、50 μg/mL)。同時，檢測其對LPS誘導的RAW 264.7細胞的毒性。山香圓葉組各孔加入含有不同濃度(0、20、40、60、80、100、120、160 μg/mL)山香圓葉提取物完全培養液100 μL，孵育2 h后加入LPS使得終濃度為1 μg/mL，空白組與溶劑組加入等體積溶劑。藥物每個濃度設4個復孔，細胞培養24 h后，吸棄原培養基，每孔加入100 μL的MTT(0.5 mg/mL)，繼續培養4 h，棄培養液，加入DMSO 0.15 mL，震蕩、混勻10 min后于酶標儀490 nm波長下測吸光度，采用MTT檢測不同濃度藥物對細胞存活率的影響。

炎癥因子IL-6、NO含量檢測：用Griess法和ELISA檢測山香圓葉揮發油對LPS誘導的RAW 264.7細胞上清液中NO和IL-6含量的影響，取小鼠RAW 264.7巨噬細胞接種于48孔培養板中，細胞密度為2×104個/mL，每孔200 μL，溫度37 ℃，5% CO2條件下培養過夜后，棄培養液，加入無血清DMEM培養基同步化24 h，山香圓葉低、中、高劑量完全培養液每孔200 μL，設置4個復孔；孵育2 h后加入200 μL的LPS使得終濃度為1 μg/mL，空白組加入等體積無血清的DMEM，陽性藥物組加入50 μg/mL的DXMS，孵育24 h后收集各孔上清液在3 000 r/min條件下離心10 min，吸取上清液，用于炎癥因子的檢測。

1.6 數據分析

數據均用“平均值±標準偏差”表示，采用GraphPad Prism 8.0進行繪圖，并用SPSS 21.0軟件進行統計分析，P<0.05表示有顯著差異，P<0.01表示有極顯著差異。

2 結果

2.1 揮發油的提取結果

采用SFE-CO2法提取得到棕黃色的山香圓葉揮發油，氣味清香。將其稱重為10.566 g，按公式：提取率=提取物質量/樣品總質量×100%，計算得其提取率為1.68%。

2.2 山香圓葉揮發油成分分析

2.2.1 GC-MS分析結果

山香圓葉揮發油直接進樣的GC-MS總離子流圖見圖1a，主要鑒定得到38個化學成分，包括(-)-α-蒎烯、棕櫚酸、棕櫚酸乙酯等(見表1)，按照峰面積歸一化法計算各成分的相對百分含量，可得其中占比較大的為亞油酸、γ-谷甾醇、角鯊烯、2,2′-亞甲基雙-(4-甲基-6-叔丁基苯酚)，分別占15.09%、7.68%、7.35%和5.6%。甲酯化處理后的GC-MS分析共鑒定得到42個化合物(見表2)，主要包括月桂酸、棕櫚酸、硬脂酸等，按照峰面積歸一化法計算各成分的相對百分含量，可得其中占比較大的為反-9-十八碳烯酸、亞油酸、棕櫚酸，分別占34.56%、10.08%和8.53%。

續表1(Continued Tab.1)

表2 山香圓葉揮發油甲酯化后的GC-MS成分分析

續表2(Continued Tab.2)

2.2.2 LC-MS分析結果

超臨界提取的油中除了揮發性的物質以外，還包含了中等極性物質。作為GC-MS的補充，LC-MS可有效地檢測這些物質。從LC-MS正負離子模式下的離子流圖可得(見圖2)，油中存在大量的中等極性物質，通過數據庫二級匹配，正離子模式下共鑒定出168個物質(見表3)，負離子模式下共鑒定出106個物質(見表4)。

表3 LC-MS正離子模式成分分析

續表3(Continued Tab.3)

續表3(Continued Tab.3)

續表3(Continued Tab.3)

續表3(Continued Tab.3)

表4 LC-MS負離子模式成分分析表

續表4(Continued Tab.4)

續表4(Continued Tab.4)

續表4(Continued Tab.4)

圖2 山香圓葉揮發油LC-MS正(a)、負(b)離子模式流圖

經人工校對，去除18個重復的化合物，最終共鑒定出256個化合物，主要為萜類、苯丙素類、酚類、黃酮類、生物堿類、香豆素及其衍生物類、脂肪酰類、倍半萜類、脂肪酸類。

2.3 山香圓葉中揮發油的抗氧化活性

山香圓葉揮發油的抗氧化活性采用IC50表示，山香圓葉揮發油對DPPH自由基的IC50為3.56 mg/mL，在相同濃度范圍內山香圓葉揮發油對ABTS自由基的抑制率則不足50%，因此，山香圓葉揮發油對DPPH的清除能力強于ABTS自由基，但對兩種自由基的清除能力均與濃度成正相關(見圖3、圖4)。

圖3 山香圓葉揮發油對DPPH自由基的清除能力(n = 3)

圖4 山香圓葉揮發油對ABTS自由基的清除能力(n = 3)

2.4 山香圓葉揮發油的抗炎活性

在評價藥物對細胞的活性之前，需要考察不同藥物濃度對細胞毒性的研究，本研究中山香圓葉揮發油濃度為20～80 μg /mL的組別中，細胞存活率與正常對照組比較無顯著性差異，但當其濃度為100～160 μg/mL時均對細胞有顯著的毒性(P<0.01)，如圖5所示，因此，選擇20～80 μg /mL濃度范圍進行后續實驗。

圖5 MTT法測定藥物對RAW 264.7細胞活性影響

藥物對LPS誘導的RAW 264.7細胞NO和IL-6分泌的影響結果如圖6所示，與對照組相比，模型組的NO和IL-6釋放量顯著升高(P<0.01)。與模型組相比，山香圓葉高、中、低劑量組均能顯著抑制NO和IL-6的釋放量(P<0.01)，且隨著藥物劑量的增加，IL-6的抑制率也逐漸增加，NO的抑制率則先減少后增加，都在高劑量組顯示出最佳的抑制結果，表明山香圓葉揮發油可顯著抑制炎性因子釋放且一定濃度范圍內呈現劑量依賴性。

圖6 山香圓葉揮發油對LPS誘導的RAW 264.7細胞NO和IL-6分泌的影響

3 討論與結論

化學成分顯著影響天然產物的活性和應用前景。從GC-MS的分析結果可以得到亞油酸類及角鯊烯等為其主要的成分。亞油酸類具有較好的生物活性，能夠調節免疫功能，幫助糖原重新合成和增強骨鈣化，并可以增加脂肪成分的分解，減少脂肪的累積，進而保護心血管系統[12-14]。類似的作用可見于(-)-α-蒎烯[15]。而且，(-)-α-蒎烯還具有抗菌作用和神經保護作用，能夠減少細菌性胃腸炎的感染以及減輕缺血性中風時的神經炎癥和細胞凋亡[16,17]。另外，角鯊烯作為山香圓葉揮發油中主要成分，具有廣泛的藥理作用，被廣泛應用于保健品、美容產品及藥品的開發中，能增強機體組織氧的利用能力，抵抗機體因缺氧而引起的各種疾病，并提高人體耐力，改善心功能。具有保肝、保腎皮質功能及抗腫瘤的作用。因此，山香圓葉揮發油具有廣泛保健品和藥品的開發前景。

另外，LC-MS鑒定到的揮發油中中小極性物質中的萜類化合物被證明了在神經保護方面具有重要作用[18,19]，苯丙素類化合物對神經退行性疾病例如阿爾茨海默病以及相關的神經炎癥也具有潛在的治療作用[20,21]。越來越多的研究表明揮發油的有效成分在神經疾病方面具有一定的藥理作用，但這些有效成分的具體作用機制仍需進一步探明，這也指明了揮發油在未來的研究方向。