南方紅豆杉菌根紫杉醇含量及其菌根菌組分離純化和種屬鑒定

彭鳳珍，杜亞填*，周春長(zhǎng)，龔雪元

1吉首大學(xué) 林產(chǎn)化工工程湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，張家界 427000；2浙江大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，杭州 310000；3基蛋生物科技股份有限公司，南京 210044

菌根是土壤真菌與植物根的共生體，菌根真菌作為一類(lèi)能與絕大多數(shù)植物根系建立互惠共生體的有益微生物，相關(guān)研究多集中其特定的形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能等方面。菌根真菌菌絲體侵染宿主植物尚未木栓化的根部，在根尖表面形成菌套，根皮層內(nèi)形成哈蒂氏網(wǎng)，根外形成外延菌絲等特征性結(jié)構(gòu)[1]，其具有促進(jìn)植物的生長(zhǎng)發(fā)育，增強(qiáng)植物的抗逆性和抗病性，提高植物吸收利用礦質(zhì)元素(尤其是N、P)能力等功能[2]，還可以通過(guò)在根際土壤和根皮層細(xì)胞間形成密集的菌絲網(wǎng)來(lái)擴(kuò)大植物根系吸收面積、提高水分利用率、促進(jìn)礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)元素的吸收和利用、改善體內(nèi)碳循環(huán)、影響植物的初生代謝和次生代謝等[3]。菌根真菌與陸地大多數(shù)植物形成密切的共生關(guān)系，且不同真菌可以同時(shí)入侵單個(gè)根片段[4]，除了上述生物學(xué)與生理生態(tài)學(xué)作用外，其還影響、參與植物根系的次生代謝，但相關(guān)研究報(bào)道甚少。

南方紅豆杉(Taxuschinensisvar.mairei)為國(guó)家一級(jí)保護(hù)植物，是紅豆杉分布在我國(guó)的1個(gè)變種，屬第四紀(jì)冰川孑遺物種，主要分布在長(zhǎng)江流域以南。紅豆杉屬的植物目前是世界上公認(rèn)瀕臨滅絕的天然珍稀抗癌植物，其根、莖、葉中均含有天然抗癌藥用成分紫杉醇及其前體物10-DABⅢ等紫杉烷類(lèi)化合物[5]。因此，為尋求新的藥源，關(guān)于南方紅豆杉內(nèi)生真菌的研究報(bào)道較多[6，7]，但關(guān)于南方紅豆杉菌根真菌的研究報(bào)道極少。張翔宇等研究紫杉醇在南方紅豆杉植物各器官組織中含量分布時(shí)發(fā)現(xiàn)[8]，須根中紫杉醇含量最高，為0.101%，之后龔雪元等[9]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)須根中有部分菌根，經(jīng)分離培養(yǎng)，從菌根組織中獲得21株菌根真菌，經(jīng)液體發(fā)酵純培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，其中4株產(chǎn)10-DABⅢ，但不產(chǎn)紫杉醇，6株產(chǎn)紫杉醇，但不產(chǎn)10-DABⅢ，但21株菌根真菌未進(jìn)行種屬鑒定。本課題對(duì)菌根進(jìn)行解剖后發(fā)現(xiàn)中心部位呈現(xiàn)出一紅色結(jié)構(gòu)區(qū)(見(jiàn)圖1)，該結(jié)構(gòu)區(qū)外均為薄壁細(xì)胞，解剖剝離出紅色結(jié)構(gòu)區(qū)發(fā)現(xiàn)其為原始根組織，經(jīng)檢測(cè)研究發(fā)現(xiàn)其中紫杉醇含量為0.209%，比須根高0.065%。本課題還進(jìn)行了南方紅豆杉菌根真菌與其莖段愈傷組織互作培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)互作之后愈傷組織的紫杉醇含量大幅度提高。菌根套是菌根相對(duì)普通須根所增加的唯一關(guān)鍵組織解剖學(xué)結(jié)構(gòu)，所以菌根套中的菌根真菌應(yīng)是菌根原始根組織中紫杉醇高積累量的關(guān)鍵作用因素，為了揭示二者間的相關(guān)性，本課題重啟組織培養(yǎng)法分離純化南方紅豆杉菌根真菌研究，擬利用形態(tài)學(xué)觀測(cè)加分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行該菌根真菌的種屬鑒定，以期獲得相關(guān)性機(jī)制方面的信息，結(jié)果與相關(guān)文獻(xiàn)[10-12]的研究報(bào)道相對(duì)比發(fā)現(xiàn)，南方紅豆杉菌根真菌的種屬多樣性與南方紅豆杉植物其他各器官組織中內(nèi)生真菌生物多樣性間存在較大差異，表明南方紅豆杉菌根真菌種屬的特異性可能與其原始根中紫杉醇高含量間存在相關(guān)性，這對(duì)紫杉醇生物合成存在多樣性生物參與、菌根真菌與植物互作生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物的研究具有非常重要的科學(xué)意義。

圖1 南方紅豆杉菌根

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

南方紅豆杉新鮮菌根、須根于2020年12月在吉首大學(xué)張家界校區(qū)后山林產(chǎn)化工工程湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室紅豆杉課題組南方紅豆杉種植基地中挖取。

南方紅豆杉莖段愈傷組織，菌根真菌混合菌與莖段愈傷組織互作的莖段愈傷組織(林產(chǎn)化工工程湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室紅豆杉課題組培養(yǎng)提供)(見(jiàn)圖2)。

圖2 南方紅豆杉菌根真菌與愈傷組織互作后的形態(tài)特征

1.2 培養(yǎng)基、主要試劑和儀器

E固體培養(yǎng)基：MS培養(yǎng)基(無(wú)激素)、1 g/L水解酪蛋白、0.5 g/L酵母浸膏、100 mL/L土豆煮濾液(100 g鮮土豆小塊，加水500 mL，煮沸30 min，過(guò)濾收集濾液即得)、12 g/L瓊脂、30 g/L蔗糖，pH5～6。上述培養(yǎng)基于121 ℃、1×105Pa滅菌30 min后倒平板備用。

主要試劑：RNA酶(捷瑞，上海)；蛋白酶(Merck，德國(guó))；2×Taq Mix(BioLinker，上海)；DNA Marker(DL9000 欣百諾，DL2000 Takara)；瓊脂糖(molecular biology grade， 翌圣)；AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒(AXYGEN，USA)；紫杉醇(壇墨質(zhì)檢-標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心，批號(hào)CU4F-A802，質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于98%)。

主要儀器：LC-1260高效液相色譜(美國(guó)安捷倫)；1260 Infinity二級(jí)管陣列檢測(cè)器；Waters Symmetry C18分析柱(250 mm ×4.6 mm ×5 μm，美國(guó)沃特世公司)；YB-150T型多功能粉碎機(jī)(永康市速鋒工貿(mào)有限公司)；R-215旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(德國(guó)海道夫)；XO-5200DT超聲波清洗器(南京先歐儀器制造有限公司)；超凈工作臺(tái)(BCM-1000A，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)；立式自動(dòng)壓力蒸汽滅菌器(GI54DWS,廈門(mén)致微儀器有限公司)；生物顯微鏡(CX-31，日本尼康)；電泳儀和凝膠成像儀(Bio Rad，美國(guó))；PCR儀(ABI9700，美國(guó))；測(cè)序儀(ABI3730，美國(guó))。

1.3 紫杉醇含量檢測(cè)

1.3.1 材料預(yù)處理

新鮮菌根，洗凈，用解剖針、細(xì)尖嘴鑷將菌根套組織從菌根的原始根組織(其上有薄紅色表皮)上剝離下來(lái)，將菌根分成菌根套組織和原始根組織兩部分，40 ℃下烘干，分別粉碎，過(guò)60 mm篩后避光干燥保存?zhèn)渲茩z測(cè)制樣用。

新鮮須根和側(cè)根，洗凈，于40 ℃下烘干后直接粉碎過(guò)60 mm篩，避光干燥保存?zhèn)渲茩z測(cè)樣用。

莖段愈傷組織于40 ℃下烘干后直接粉碎過(guò)60 mm篩，避光干燥保存?zhèn)渲茩z測(cè)樣用。

選取與菌根真菌混合菌互作10天的莖段愈傷組織，于40 ℃下烘干后直接粉碎過(guò)60 mm篩，避光干燥保存?zhèn)渲茩z測(cè)樣用。

1.3.2 供試品檢測(cè)樣的制備

準(zhǔn)確稱(chēng)取上述各種材料的干燥樣品各1.000 g，同時(shí)另取相同材料檢測(cè)含水量，菌根套、菌根原始根組織、須根、側(cè)根和莖段愈傷組織(未互作和互作的愈傷組織)干燥材料中的含水量分別為：α1=(4.11±0.11)%，α2=(6.66±0.17)%，α3=(15.11±0.24)%，α4=(8.38±0.30)%，α5=(2.78±0.15)%，α6=(2.56±0.17)%(均為5次重復(fù)的平均值)。之后將準(zhǔn)確稱(chēng)取的材料分別置于100 mL三角瓶中，各加入40 mL甲醇，超聲提取1 h，靜置充分澄清后收集上清液，沉淀復(fù)加等體積甲醇，重復(fù)操作3次，合并上清液，過(guò)濾除渣，濾液于40 ℃減壓蒸干，先用適量的甲醇溶解，再用30 mL二氯甲烷復(fù)溶，用二氯甲烷∶水=2∶1(V/V)萃取，重復(fù)3次。棄去水相，合并三次二氯甲烷相，40 ℃減壓濃縮，后用少量甲醇(色譜級(jí))充分洗出濃縮瓶中固形物于2 mL容量瓶中定容，最后用0.45 μm微孔膜過(guò)濾至Tube管中，置于冰箱中冷藏備檢測(cè)用。

1.3.3 對(duì)照品溶液的制備

精密稱(chēng)取紫杉醇對(duì)照品10.00 mg，置于5 mL容量瓶中，用甲醇(色譜級(jí))溶解并定容制成標(biāo)準(zhǔn)溶液備用。

1.3.4 色譜條件及梯度洗脫方案

檢測(cè)波長(zhǎng)227 nm，進(jìn)樣量20 μL，流速1 mL/min，柱溫30 ℃。用乙腈和磷酸水為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，即乙腈(A)∶0.01%磷酸水(B)為：0～10 min，20%→40% A；10～14 min，40%→50% A；14～25 min，50% A；25～26 min，50%→100% A；26～30 min，100% A；30～35 min，100%→20% A。

1.3.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

分別精密吸取紫杉醇對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)液0.02、0.06、0.1、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于1 mL容量瓶中，用色譜級(jí)甲醇定容至1 mL，按“1.3.4”依次進(jìn)樣檢測(cè)。以紫杉醇濃度y(mg/mL)為函數(shù)，峰面積值x為自變量，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立回歸方程：y=7.06×10-5x+0.004 8(R2=0.999 4，n=7)，表明紫杉醇在0.04～2 mg/mL濃度范圍內(nèi)濃度與峰面積值之間具有良好的線性關(guān)系。

1.3.6 精密度試驗(yàn)

以2 mg/mL紫杉醇對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)液為檢測(cè)樣，按“1.3.4”重復(fù)檢測(cè)5次，測(cè)得峰面積值分別為27 435.4、28 748.6、28 254.9、27 638.3、29 190.8，其RSD值為2.61%。

1.3.7 重復(fù)性試驗(yàn)

精確稱(chēng)取“1.3.1”制取的南方紅豆杉須根干粉末5份，各1.000 g，分別按“1.3.2”方法制備成檢測(cè)樣，按“1.3.4”進(jìn)樣檢測(cè)，分別測(cè)得紫杉醇的峰面積值為11 001.9、10 810.5、11 269.4、11 542.3、11 727.4，其RSD值為3.32%。

1.3.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

用已知濃度為1.6 mg/mL紫杉醇對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)液，按“1.3.4”方法分別于0、4、8、12、24 h后進(jìn)樣檢測(cè)，測(cè)得紫杉醇峰面積值分別為23 363.2、22 011.3、23 667.7、22 594.5、21 312.5，其RSD為4.27%，結(jié)果表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

1.3.9 加樣回收率試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱(chēng)取按“1.3.1”中方法制取的南方紅豆杉菌根干粉樣品5份，每份1.000 g，分別加入濃度0.2 mg/mL紫杉醇對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)溶液各1.00 mL，然后按“1.3.2”方法制備檢測(cè)樣，按“1.3.4”方法進(jìn)樣檢測(cè)紫杉醇含量，得紫杉醇的加樣回收率為84.68%(平均值，RSD值為1.70%)。

1.4 菌根真菌的分離與純化

將新采集菌根充分沖洗，用軟毛刷輕微擦拭去除菌根表面的泥土和雜質(zhì)，后置于錐形瓶中，加入適量蒸餾水震蕩清洗，然后于無(wú)菌工作臺(tái)中夾出剪切成0.5 cm小段，置于無(wú)菌瓶中，用70%酒精浸泡10 s后倒掉酒精，再改用無(wú)菌水反復(fù)震蕩清洗20次，取出菌根段置于無(wú)菌培養(yǎng)皿中備接種用。取少量最后一次清洗液，備作材料表面非菌根菌殘留排除接種用。

用解剖刀將上述經(jīng)無(wú)菌水反復(fù)清洗滅菌后的菌根段切成1～2 mm薄片，接種于E固體平面培養(yǎng)基上，于26 ℃恒溫箱中培養(yǎng)，每天仔細(xì)觀察，只要薄片上有菌落點(diǎn)出現(xiàn)便立即挑取轉(zhuǎn)接于固體斜面培養(yǎng)基上擴(kuò)增培養(yǎng)，3～7天后據(jù)菌落形態(tài)特征觀察，若為單菌株菌落，則任其長(zhǎng)滿斜面，若為一個(gè)以上菌株，待菌落充分?jǐn)U展后挑取菌落邊緣菌絲搗碎、稀釋?zhuān)媒臃N環(huán)蘸取菌液于培養(yǎng)皿固體平面培養(yǎng)基上劃線接種培養(yǎng)，待新的菌落點(diǎn)出現(xiàn)后立即轉(zhuǎn)接，反復(fù)進(jìn)行，直到獲得顯微觀測(cè)形態(tài)特征單純一致的菌株。

對(duì)照組：無(wú)菌吸取100 μL最后一次菌根清洗液，均勻涂布接種于E固體平板培養(yǎng)基上，于上述相同培養(yǎng)條件下培養(yǎng)3～7天后若出現(xiàn)菌落點(diǎn)，則立即用接種針將菌落點(diǎn)仔細(xì)無(wú)菌挑取轉(zhuǎn)接于固體斜面培養(yǎng)基上，于上述相同條件下培養(yǎng)，備與上述所獲菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)比較，為非菌根菌排除對(duì)象。若未出現(xiàn)菌落點(diǎn)，說(shuō)明上述分離純化培養(yǎng)所獲得菌株全為菌根菌。

1.5 菌株形態(tài)學(xué)觀測(cè)分析鑒定

根據(jù)菌株在固體培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)狀態(tài)、菌落顏色和菌絲是否有隔、分枝、大小、分生孢子等的光學(xué)顯微形態(tài)觀測(cè)，進(jìn)行菌株種類(lèi)的初步分析鑒別，并拍照記錄。

1.6 菌株分子生物學(xué)分析鑒定

根據(jù)上述形態(tài)學(xué)觀測(cè)所獲得的初步分析鑒定結(jié)果，進(jìn)一步采用分子生物學(xué)方法進(jìn)行菌株的種屬分析鑒定，采用蛋白酶K裂解的方法對(duì)各菌株基因組DNA進(jìn)行抽提，分別各取3 μL進(jìn)行單向凝膠電泳分離。即將純化后的菌根真菌基因組DNA作為模板，選用通用引物ITS1-F(5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′)和ITS2-R(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)，經(jīng)PCR擴(kuò)增后再在1%瓊脂糖凝膠薄板中進(jìn)行電泳分離，采用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒進(jìn)行回收，在ABI3730測(cè)序儀上進(jìn)行測(cè)序。

PCR反應(yīng)體系：Biolinker 2×Taq Mix 20 μL，正反向引物(10 μM)各1 μL，模板DNA 20～50 ng，補(bǔ)充超純水至40 μL。

PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃修復(fù)延伸5 min，10 ℃保持10 min。

1.7 數(shù)據(jù)分析

去掉測(cè)序結(jié)果起始和末端質(zhì)量差的堿基，將序列和NCBI進(jìn)行Blast比對(duì)，找到Identity最高的物種信息，作為該序列的物種信息，并得到他的Lineage。選擇Identity最高的前10個(gè)物種信息，去掉比對(duì)上的重復(fù)的序列信息，利用Mega5.0軟件對(duì)序列進(jìn)行比對(duì)并通過(guò)鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)，最終得出菌株所屬種屬。

2 結(jié)果與分析

2.1 南方紅豆杉根系及其莖段愈傷組織中紫杉醇的含量

經(jīng)檢測(cè)研究(見(jiàn)表1)發(fā)現(xiàn)，南方紅豆杉菌根原始根組織中紫杉醇含量最高，為0.209%，比須根高0.065%，比側(cè)根高0.046%，菌根套組織中紫杉醇含量較低，即南方紅豆杉根系中紫杉醇積累量最高的組織解剖學(xué)結(jié)構(gòu)是菌根中的原始根組織。進(jìn)一步檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，南方紅豆杉莖段愈傷組織中紫杉醇含量為0.037%，與菌根真菌共培養(yǎng)互作后的莖段愈傷組織紫杉醇含量為0.063%，是未互作的愈傷組織的1.72倍。結(jié)果表明，南方紅豆杉菌根中原始根組織之所以能積累較高紫杉醇的含量，關(guān)鍵的生物學(xué)機(jī)制是菌根真菌與菌根套組織薄壁細(xì)胞間的互惠共生互作及其關(guān)系持續(xù)穩(wěn)定的維持。

表1 南方紅豆杉根各部位及愈傷組織中紫杉醇含量

2.2 南方紅豆杉菌根真菌形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)種屬分析鑒定及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

經(jīng)分離純化，從南方紅豆杉菌根組織中共獲得30個(gè)真菌菌株，其中編號(hào)為Myc-7、Myc-22的兩菌株，經(jīng)反復(fù)分離培養(yǎng)未能純化而被淘汰，菌根材料表面滅菌處理最后一次菌根清洗液涂布培養(yǎng)無(wú)菌落產(chǎn)生，表明其余28個(gè)菌株均為菌根菌。經(jīng)菌落、菌絲、子實(shí)體等的形態(tài)學(xué)結(jié)合光學(xué)顯微觀測(cè)(見(jiàn)圖3)初步鑒定，Myc-15、Myc-19、Myc-20為同種菌株，因此最終確定所采樣地內(nèi)南方紅豆杉菌根組織中的菌根菌株數(shù)為26株。基因組DNA經(jīng)抽提、擴(kuò)增、凝膠電泳(見(jiàn)圖4、圖5)、rDNA-ITS測(cè)序、與NCBI進(jìn)行blast比對(duì)分析，相似度為99%～100%(見(jiàn)表2)，結(jié)合《真菌鑒定手冊(cè)》[13]《半知菌分屬圖冊(cè)》[14]形態(tài)學(xué)鑒定，再運(yùn)用Mega5.0軟件中的 Neighbor-joining 法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(見(jiàn)圖6)確定了菌株的系統(tǒng)發(fā)育地位，最后得出：26株菌根真菌種屬分屬3門(mén)6綱9目11科14屬，其中92.308%的菌株屬于子囊菌門(mén)(24株)，3.846%的菌株屬于半知菌亞門(mén)(1株)，3.846%的菌株屬于擔(dān)子菌門(mén)(1株)。子囊菌門(mén)包括以曲霉屬(Aspergillus，5株)、木霉菌屬(Trichoderma，5株)為優(yōu)勢(shì)10菌株和鐮孢霉屬(Fusarium)、青霉屬(Penicillium)、Cylindrodendrum屬、小帚梗柱孢屬(Cylindrocladiella)、螺旋聚孢霉屬(Clonostachys)、炭角菌屬(Xylaria)、枝孢霉屬(Cladosporium)、棒孢屬(Corynespora)、Paraboeremia屬、無(wú)柄盤(pán)菌屬(Pezicula)的真菌。半知菌亞門(mén)僅刺盤(pán)孢屬1屬(Colletotrichum)。擔(dān)子菌門(mén)也僅煙管菌屬1屬(Bjerkandera)。

2.2.1 菌株形態(tài)學(xué)分析

Cylindrodendrum：菌株Myc-1(見(jiàn)圖3)菌株為Cylindrodendrum屬，E培養(yǎng)基培養(yǎng)7～8天長(zhǎng)滿整個(gè)培養(yǎng)基，顯出絨毛狀的氈狀氣生菌絲體，培養(yǎng)基上的顏色從白色變?yōu)辄S色，最后變?yōu)樯钭厣?。菌絲非常粗有分枝且有橫隔，分生孢子梗輪狀分枝，分生孢子卵圓形。

圖3 南方紅豆杉菌根真菌各菌株的形態(tài)學(xué)特征

小帚梗柱孢屬(Cylindrocladiella)：菌株Myc-2、Myc-13為小帚梗柱孢屬，在E培養(yǎng)基培養(yǎng)5～6天長(zhǎng)滿整個(gè)培養(yǎng)基，菌面濕潤(rùn)，菌落呈褐色，氣生菌絲白色。菌絲無(wú)色、分枝、有分隔。分生孢子梗呈青霉?fàn)罘种Γ稚咦訄A柱形。

鐮孢霉屬(Fusarium)：菌株Myc-15、Myc-16、Myc-17為鐮孢霉屬，在E培養(yǎng)基培養(yǎng)3～4天長(zhǎng)滿整個(gè)培養(yǎng)基，菌絲在培養(yǎng)基上擴(kuò)展呈棉絮狀。菌株Myc-15氣生菌絲為白色，培養(yǎng)基上有粉紅色滲出物；菌株Myc-16氣生菌絲為白色，培養(yǎng)基上有紫紅色滲出物；菌株Myc-17菌落呈紫紅色，有黃色滲出物。菌絲分枝不規(guī)則或著生一圈小梗，在孢子座上單生或成群生，且分生孢子梗不一。大型分生孢子包含幾個(gè)細(xì)胞，典型的鐮刀形；小型分生孢子為單胞呈卵圓形，單個(gè)著生或成鏈。

螺旋聚孢霉屬(Clonostachys)：菌株Myc-18為螺旋聚孢霉屬，在E培養(yǎng)基黑暗培養(yǎng)3～4天長(zhǎng)滿整個(gè)培養(yǎng)基，菌落在培養(yǎng)基上擴(kuò)展呈白色絲狀。分生孢子梗是帚狀分枝，有少量的厚垣孢子產(chǎn)生，分生孢子為橢圓形。

木霉菌屬(Trichoderma)：菌株Myc-24、Myc-26、Myc-27、Myc-28為木霉菌屬，菌株Myc-24、Myc-28在E培養(yǎng)基培養(yǎng)3～4天長(zhǎng)滿整個(gè)培養(yǎng)基，而菌株Myc-26、Myc-27在E培養(yǎng)基培養(yǎng)5～6天長(zhǎng)滿整個(gè)培養(yǎng)基。4株菌株最終形成氈狀、柔毛狀、羊絨狀和蛛網(wǎng)狀的氣生菌絲，菌落顏色從無(wú)色到淺黃色、綠色、琥珀色或者黃綠色。其分生孢子梗連續(xù)重復(fù)多次分枝，排列成樹(shù)狀結(jié)構(gòu)，分生孢子為單細(xì)胞呈橢球形。

炭角菌屬(Xylaria)：菌株Myc-30為炭角菌屬，在E培養(yǎng)基培養(yǎng)7～8天長(zhǎng)滿整個(gè)培養(yǎng)基，菌落圓形分層呈短絨毛狀白色氣生菌絲。菌絲分枝，側(cè)枝線形，頂端常變厚并呈頂環(huán)構(gòu)造，且氣生菌絲頂端橫隔分裂形成鏈狀孢子。子囊單囊壁壁薄，子囊孢子單胞呈卵形或橢圓形。

青霉屬(Penicillium)：菌株Myc-4、Myc-12為青霉屬，在E培養(yǎng)基培養(yǎng)3～4天長(zhǎng)滿整個(gè)培養(yǎng)基。菌落圓形生長(zhǎng)，表面濕潤(rùn)。菌株Myc-4菌落為軍綠色，反面呈黃色；菌株Myc-12菌落為深橄欖綠色，反面呈菊黃色。分生孢子梗自菌絲單個(gè)地發(fā)生或不常成束，在頂部附近分枝，末端生小梗，分生孢子球形或卵圓形。

曲霉屬(Aspergillus)：菌株Myc-3、Myc-5、Myc-6、Myc-10、Myc-11為曲霉屬，在E培養(yǎng)基培養(yǎng)3～4天長(zhǎng)滿整個(gè)培養(yǎng)基。菌落是圓形，中間略凸，初為白色，后漸變?yōu)樽厣?，最后變?yōu)楹谏?，菌落反面呈淡黃色。分生孢子梗由一根直立的菌絲形成，菌絲的末端形成球狀膨脹(頂囊)，分生孢子為球形，于頂囊處呈串鏈生長(zhǎng)。

枝孢霉屬(Cladosporium)：菌株Myc-8為枝孢霉屬，在E培養(yǎng)基培養(yǎng)3～4天長(zhǎng)滿整個(gè)培養(yǎng)基。其菌落顏色從橄欖綠到啡黑色，背面為黑色，質(zhì)地的變化由柔軟到粉末狀再到羊毛樣，菌落的生長(zhǎng)方向從中央向四周分散。菌絲為細(xì)枝狀分枝且有隔，有分生孢子梗，分生孢子成串狀并呈頂端生長(zhǎng)。

棒孢屬(Corynespora)：菌株Myc-9為棒孢屬，在E培養(yǎng)基培養(yǎng)3～4天長(zhǎng)滿整個(gè)培養(yǎng)基。菌落黃卡其色，圓形生長(zhǎng)，中心有凸起，背面呈墨綠色。菌絲無(wú)隔膜，分生孢子梗長(zhǎng)且單身，極少有分枝，呈圓柱狀，分生孢子圓形。

Paraboeremia：菌株Myc-14為Paraboeremia屬，在E培養(yǎng)基培養(yǎng)7～8天長(zhǎng)滿整個(gè)培養(yǎng)基。菌落灰橄欖色呈圓形生長(zhǎng)，絮狀氣生菌絲。菌絲有隔有分枝，分生孢子器壁擬薄壁組織狀黑棕色，翁形或近球形，單生。分生孢子為單胞，圓柱形或橢圓形。

無(wú)柄盤(pán)菌屬(Pezicula)：菌株Myc-23為無(wú)柄盤(pán)菌屬，在E培養(yǎng)基培養(yǎng)3～4天時(shí)菌落白色，7天時(shí)長(zhǎng)滿整個(gè)培養(yǎng)基菌落，呈灰色棉絮狀。菌絲有分枝有隔，產(chǎn)生圓柱狀或進(jìn)球狀厚垣孢子，分生孢子呈卵圓形。

刺盤(pán)孢屬(Colletotrichum)：菌株Myc-29為刺盤(pán)孢屬，在E培養(yǎng)基培養(yǎng)5～6天長(zhǎng)滿整個(gè)培養(yǎng)基。菌落圓形生長(zhǎng)，背面呈黃色，菌絲有分枝有隔。球形分生孢子堆，分生孢子單胞，無(wú)隔無(wú)色，長(zhǎng)橢圓形，產(chǎn)于瓶狀小梗上，萌發(fā)后產(chǎn)生附著胞。

煙管菌屬(Bjerkandera)：菌株Myc-21為煙管菌屬，在E培養(yǎng)基培養(yǎng)5～6天長(zhǎng)滿整個(gè)培養(yǎng)基。菌落圓形，邊緣平整，呈白色絨毛狀。菌絲呈樹(shù)狀分枝，具有鎖狀聯(lián)合孢子球形。

2.2.2 菌株分子生物學(xué)分析

采用蛋白酶K裂解方法抽提的基因組DNA，各取3 μL點(diǎn)于1%瓊脂糖凝膠板上，經(jīng)電泳后得到的各菌株基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳圖(見(jiàn)圖4)顯示，各樣本基因組間存在明顯差異，形態(tài)學(xué)觀測(cè)結(jié)果得到驗(yàn)證。

圖4 各菌株基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳圖

樣本基因組DNA的PCR產(chǎn)物(各取3 μL)于1%瓊脂糖凝膠上樣電泳后的結(jié)果(見(jiàn)圖5)表明：ITS片段條帶單一，大小正確，濃度適中，可用于測(cè)序。

圖5 各菌株rDNA-ITS片段PCR擴(kuò)增后的瓊脂糖凝膠電泳圖

ITS片段大小約為600 bp，由于測(cè)序起始端測(cè)序質(zhì)量較差，所以我們?nèi)コ|(zhì)量較差的序列后得到了測(cè)序結(jié)果，經(jīng)與NCBI進(jìn)行Blast比對(duì)分析，相似度為99%～100%(見(jiàn)表2)，再運(yùn)用Mega 5.0軟件中的Neighbor-joining 法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(見(jiàn)圖6)，確定了被測(cè)菌株的系統(tǒng)發(fā)育地位，最終獲得了26株菌株的種屬結(jié)果(見(jiàn)表2)。

表2 南方紅豆杉菌根真菌rDNA-ITS序列與相近菌株相似性比對(duì)

續(xù)表2(Continued Tab.2)

圖6 菌株系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

3 討論與結(jié)論

全球紅豆杉屬植物有11種，包括1個(gè)變種和1個(gè)雜交種，其中有9種紅豆杉屬植物內(nèi)生真菌具有產(chǎn)生紫杉醇的能力[15]。Li等[16]用產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌培養(yǎng)液與東北紅豆杉懸浮培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)處理，結(jié)果顯示其不僅可提高紫杉醇的釋放率，而且不會(huì)引起東北紅豆杉細(xì)胞膜的明顯傷害，說(shuō)明內(nèi)生真菌發(fā)酵液可能具有激活紫杉醇主動(dòng)運(yùn)輸相關(guān)酶類(lèi)的功能活性。也有研究表明榛樹(shù)細(xì)胞與菌株的共培養(yǎng)也有效，其中真菌接種量和共培養(yǎng)時(shí)間是在該共培養(yǎng)系統(tǒng)中實(shí)現(xiàn)紫杉醇最大產(chǎn)量的重要因素[17]。但內(nèi)生真菌與紅豆杉細(xì)胞在紫杉醇生物合成過(guò)程中究竟是怎樣的生物學(xué)關(guān)系，一直未見(jiàn)有明確的報(bào)道，Gong等[9]報(bào)道了南方紅豆杉菌根菌具有產(chǎn)紫杉醇和10-DABⅢ的能力，但經(jīng)繼代培養(yǎng)后即快速衰減直至消失，故菌根菌與菌根原始根組織中較高紫杉醇含量間的相關(guān)機(jī)制，仍然具有深入研究的價(jià)值。

有專(zhuān)著將紅豆杉植物定為內(nèi)生菌根植物[18]，并指出南方紅豆杉可與叢枝菌根真菌形成叢枝-囊泡型菌根。孢子的形態(tài)多樣性不足以揭示生態(tài)系統(tǒng)中真菌的實(shí)際多樣性，在菌根真菌研究中應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)，可使其分類(lèi)多樣性顯著增加，研究表明種群內(nèi)甚至單個(gè)孢子內(nèi)的遺傳多樣性都很高[19]。此外，有證據(jù)表明，菌根真菌群落組成的差異可能對(duì)植物產(chǎn)生不同的影響，并在決定植物多樣性、生態(tài)系統(tǒng)多樣性和生產(chǎn)力方面發(fā)揮潛在的作用[20]。本研究結(jié)果顯示，南方紅豆杉菌根具有不同于其他器官組織內(nèi)生真菌[10-12]的菌群，其原始根組織中有遠(yuǎn)高于普通根及其他器官組織的紫杉醇含量，且愈傷組織與菌根菌互作可提高其紫杉醇含量。因此，菌根菌與南方紅豆杉根細(xì)胞在紫杉醇生物合成過(guò)程中的互作協(xié)同機(jī)制，是非常值得研究的重要方向，這對(duì)菌根菌的開(kāi)發(fā)利用和天然有機(jī)功能活性化合物的高效綠色生產(chǎn)等具有非常重要的科學(xué)意義和應(yīng)用價(jià)值。