刺齒鳳尾蕨中金雀異黃酮的提取與分離

2022-05-25 09:20:28張學晶段晨晨李春斌石玉生

大連民族大學學報 2022年1期

張學晶，車暢，段晨晨，李春斌，石玉生

(大連民族大學生命科學學院，遼寧大連 116605)

鳳尾蕨科植物(Pteridaceae)全球約有10屬，共400余種，廣泛分布于熱帶地區和亞熱帶地區，熱帶美洲地區最多[1]。中國國內鳳尾蕨科植物主要分布于西南及華南地區，少數種類向北到達華東及秦嶺南坡。鳳尾蕨屬植物中大多含有黃酮及其苷類、二萜、倍半萜和多糖等多種類型化學成分，其中黃酮類成分能被人體迅速吸收，具有抗疲勞、保護血管、擴張毛細血管、防動脈硬化、抗脂肪氧化及抗衰老等功能[2]。現代藥理研究表明黃酮類化合物具有顯著的生理活性，如保肝、抑菌、抗癌、降血糖和降血脂等作用[3]。

國外學者對鳳尾蕨屬植物的研究較早，中國起步較晚。Murakami T等[4]從刺齒鳳尾蕨中分離得到了5種二萜類化合物，對多種腫瘤細胞有抑制作用；1999年Lu等[5]從鳳尾草中分離得到2種黃酮類化合物：芹菜素和木犀草素；張曉等[6]從半邊旗中分離得到5種化合物，對多種癌細胞增殖有顯著抑制作用；2013年，CHEN等[7]從劍葉鳳尾蕨中分離得到倍半萜，對結核分枝桿菌具有抑制作用，表現出抗結核活性；2014年姚學軍等[8]從鳳尾草中分離得到2類二萜；2016年，張艷等[9]從劍葉鳳尾蕨全草中分離得到8類二萜類化合物和2類倍半萜類化合物，并且細胞毒活性測試表明，其中的化合物crotonkinin E、crotonkinin F、pterisolic acid A和pterisolic acid C具有一定抑制人結腸癌細胞HCT-116、肝癌細胞HepG2和人胃癌細胞BGC-823的活性；2017年，孫丹等[10]從刺齒鳳尾蕨中分離得到5種二萜類化合物，可顯著抑制人源結腸癌細胞活性；周艷麗等[11]在刺齒鳳尾蕨中分離得到10類化合物，發現其中3類化合物對皮質酮誘導PC12細胞損傷具有較強的保護作用。

刺齒鳳尾蕨(Pteris dispar Kunze)，別名刺齒半邊旗[12]，為鳳尾蕨科鳳尾蕨屬藥用植物，具有清熱解毒、止血祛痰的功效[10]，民間常用于治療腸炎、痢疾、瘡毒及婦科疾病[13]。刺齒鳳尾蕨的提取物對多種腫瘤細胞的增殖具有明顯的抑制作用[14,15]。刺齒鳳尾蕨提取物對人癌細胞具有明顯抑制作用。近年來研究者從劍葉鳳尾蕨、巖鳳尾蕨、半邊旗等多種鳳尾蕨屬植物中分離并鑒定了多種具有抗腫瘤活性的貝殼杉烷型二萜類化合物。而對刺齒鳳尾蕨較少進行系統的化學成分及生物活性研究。根據藥用植物親緣學原理，親緣關系相近的植物一般含有結構相似的化學成分，而結構相似的化合物一般具有相似的生理活性。為從鳳尾蕨屬植物中尋找更多更有效的活性成分，選擇刺齒鳳尾蕨作為研究對象，設計實驗方案進行提取與制備，以期發現活性較強、含量較高的萜類化合物以及黃酮類化合物。

1 儀器與材料

1.1 試驗儀器

200 L提取濃縮機組(北京中聯臺電機械有限公司)，旋轉蒸發儀(上海亞榮生化儀器廠)，高效液相色譜儀(日本島津)，半制備等度液相色譜(北京賽諾華博科技有限責任公司)，分析色譜柱(Agela Technologies)半制備色譜柱(Agela Technologies)，核磁共振儀(美國Varian公司)。

1.2 試驗材料

刺齒鳳尾蕨采集于廣東湛江市廉江市塘蓬鎮，鑒定為刺齒鳳尾蕨全草。

本實驗中用到的無水乙醇、石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、甲醇(天津市科密歐化學試劑有限公司)均為分析純，甲醇(天津市科密歐化學試劑有限公司)、三氟乙酸(Avantor Performance Materials)為色譜純，水為雙蒸水。聚酰胺樹脂(14～30目)，ODS C18(50 μm，60 A)。

2 試驗方法

2.1 刺齒鳳尾蕨的提取與萃取

刺齒鳳尾蕨全草(10 kg)晾干，用粉碎機粉碎后經95%乙醇溶液浸泡4 h，加熱回流提取3次，每次3 h，回收后得到浸膏1.1 kg。浸膏用少量水分散溶解，分別用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取，石油醚萃取收集上清液得石油醚萃取物(540 g)；用二氯甲烷萃取，收集下層萃取液得，二氯甲烷萃取物(100 g)；用乙酸乙酯萃取，收集上清液得乙酸乙酯萃取物(90 g)，再用正丁醇萃取，取上清液，得正丁醇萃取物(45 g)。

2.2 聚酰胺樹脂柱色譜分離

二氯甲烷萃取物用聚酰胺樹脂柱色譜洗脫，分別用水和不同濃度的乙醇(30%、60%、95%)進行梯度洗脫，減壓回收各組分得到水洗脫物(26 g)、30%乙醇洗脫物(17 g)、60%乙醇洗脫物(10 g)和95%乙醇洗脫物(7 g)四個部位(Fr.A～Fr.D)。

2.3 中壓制備液相色譜分離

將聚酰胺樹脂柱色譜分離得到的Fr.A用中壓制備液相色譜分離，用甲醇-水梯度洗脫，甲醇濃度變化梯度為5%，變化范圍5%～80%。500 ml為一個組分，共得55個組分(Fr.1～Fr.55)。

Fr.16組分用全波長高效液相色譜進行檢測分析，通過半制備HPLC用甲醇:水為35:65，作為流動相分離得到化合物X(6.8 mg)。

3 化合物結構鑒定

化合物X：白色粉末；1H NMR(600 MHz，CD3OD) δ:8.05 (1H，s，H-2)，7.37 (2H，d，J=8.6 Hz，H-2′，6′)，6.84 (2H，d，J=8.6 Hz，H-3′，5′)，6.34 (1H，d，J=2.1 Hz，H-8)，6.22 (1H，d，J=2.1 Hz，H-6)，13C NMR(CD3OD，150 MHz) δ:182.55 (s，C-4)，166.26 (s，C-7)，164.16 (s，C-5)，160.02 (d，C-2)，159.12 (s，C-9)，155.09(s，C-4′)，131.67 (d，C-2′，6′)，125.03 (s，C-3)，123.60 (s，C-1′)，116.55 (d，C-3′，5′)，106.58 (s，C-10)，100.40 (d，C-6)，95.06(d，C-8)。將其核磁數據與文獻[16]對照，鑒定化合物為4′,5,7-Trihydroxyisoflavone，金雀異黃酮。

化合物X結構如圖1。