花生四烯酸誘導建立大鼠彌漫性腦血栓模型

寧 瓏, 孫 航, 馮 晉, 孟慶婷, 楊 茜, 何芳雁

(云南中醫藥大學中藥學院,昆明 650000)

缺血性腦卒中（ischemic stroke）是我國腦血管疾病中發病率最高的病種。雖然在時間窗內（＜4.5 h）使用組織纖維溶酶原激活物（tissue-plasminogen activator，t-PA）溶栓可改善大部分缺血性腦卒中患者的預后［1］，但會增加患者出血轉化（hemorrhagic transformation）的風險；如超時間窗使用，其風險將增加10倍，死亡率提高10%～40%［2］。由于缺血性腦卒中臨床病情復雜，臨床前研究需根據病因、缺血時間及損傷程度等選擇適合的缺血性腦卒中模型，同時還須考慮模型的穩定性、可靠性、易行性、經濟性等特征。臨床彌漫性腦血栓是造成缺血性腦卒中的主要原因之一。

1988 年Cahn 等［3］利用花生四烯酸（arachidonic acid）誘導血小板活化與聚集、血管內皮損傷，其在體內可代謝為血栓素A2、白三烯等多種產物，使血栓素A2與前列腺素I2的比例失衡，促使血小板聚集、血管收縮，形成腦血栓；并且在花生四烯酸引起的腦血栓損傷后幾分鐘內即可發生血管源性腦水腫和血腦屏障損傷［4］。因此，通過該方法可以建立操作簡單、手術時間短、對實驗動物創傷程度低的大鼠彌漫性腦血栓模型。然而由于當時的操作細節不夠完善，例如手術切口不合理、未規定花生四烯酸的保存方式、麻醉藥物選用不合適等原因，該模型復制的穩定性差、死亡率高，限制了推廣應用。

本實驗總結了通過頸內動脈注射花生四烯酸建立大鼠彌漫性腦血栓模型的操作要點，完善操作細節，并以腦組織伊文思藍（Evans blue，EB）滲出含量及缺血病理損傷程度為依據，對模型的成功率及穩定性進行評價。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

4～8 周齡的SPF 級雄性SD 大鼠24 只，體質量為250～300 g，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供［SCXK （湘） 2019-0004］，質量合格證號為430727210100499718。動物飼養于云南中醫藥大學動物實驗室［SYXK（滇）K2017-0005］，飼養室溫度為20～25 ℃，相對濕度為50%～65%，日光燈照明12 h，自由進食與飲水。動物實驗方案經本單位實驗動物倫理委員會審批通過（編號R-062019LH001）。

1.2 藥物與試劑

花生四烯酸（批號XKN3C-JG）購自東京化成工業株式會社；阿托品（批號130404）購自上海禾豐制藥有限公司；多聚甲醛（批號20100525）購自天津化學試劑研究所；異氟烷（批號217180101）購自深圳市瑞沃德生命科技與限公司；肝素鈉注射液（批號151607006A）購自常州千紅生化制藥股份有限公司；EB（批號L04D11J133367）購自上海源葉生物科技有限公司；蘇木精（批號1612154094）、伊紅（批號1612154094）均購自福州邁新生物技術開發有限公司；鹽酸（批號20081215）購自成都市科龍化工試劑廠；中性樹膠（批號20150202）購自上海標本模型廠。

1.3 主要儀器

石蠟包埋機（型號HISTOSTATS）和石蠟切片機（型號Microm HM）為賽默飛世爾科技（中國）有限公司產品；顯微鏡（型號Nikon DS-U3）為日本NIKON公司產品；數字式超級恒溫浴槽（型號IISS-1B）為成都儀器廠產品；烘箱（型號DHG-9140A）為上海慧泰儀器制造有限公司產品；電子分析天平（型號AB204-S）為瑞士Mettler Toledo公司產品；小動物麻醉機（型號V1824301）為美國Marex公司產品。

1.4 花生四烯酸的配制及保持方法

向規格為50 mg/支的花生四烯酸中加入10 mL 濃度為100 mmol/L 的Na2CO3，分裝后沖氮氣密封保存于－80 ℃冰箱備用；使用前用生理鹽水（即0.9%NaCl溶液）將花生四烯酸稀釋到質量濃度為0.5 g/L，現用現配。

1.5 大鼠彌漫性腦血栓模型復制

將大鼠隨機分為假手術組和模型組，每組12 只（一半用于EB 染色，一半用于HE 染色）。用異氟烷吸入麻醉，并肌內注射治療劑量的阿托品。使右側頸部皮下筋膜暴露，鈍性分離右側頸總動脈、頸外動脈，并結扎頸外動脈分支和頸總動脈近心端，在其遠心端用動脈夾夾緊，顯微剪在頸總動脈游離端剪一個小口，插入導管，去除動脈夾。將0.5 mg/kg花生四烯酸（0.1 mL/100 g 體質量）經導管（使用前先經肝素-生理鹽水抗凝處理）注入頸總動脈，后結扎遠心端動脈，進行縫合。實驗過程中使大鼠仰臥于加熱墊上，保持肛溫恒定在37 ℃［3，5］。假手術組鈍性分離右側頸總動脈、頸外動脈后即可進行縫合，不注入任何藥物。

1.6 腦組織中EB含量測定

注入花生四烯酸后5 min 立即注入0.2%（0.5 mL/100 g 體質量）EB，再過5 min 后立即用手術剪斷頭處死動物，開顱取出大腦，腦組織沿腦橋上界面切斷，去除嗅球。按圖1所示，在腦前極與視交叉連線中點、視交叉處、漏斗柄處以及漏斗柄與后葉尾極之間冠狀方向將腦分為5 塊組織。拍照后將腦組織放入勻漿器中，加入5 mL 0.5% Na2SO4及丙酮（3∶7）混合液制成勻漿液，試管密封靜置60 min 以上；經3 000 r/min離心10 min，取上清液在620 nm波長處測定吸光度值。以栓塞側的吸光度值與腦質量之比表示EB的含量，反映腦血栓的嚴重程度。

圖1 大鼠彌漫性腦血栓模型的腦組織冠狀切塊示意圖Figure 1 Coronal slices of brain tissue in rats with diffuse cerebral thrombosis

1.7 HE染色觀察腦組織病理改變

按1.6 節方法取腦、切塊后，4%多聚甲醛溶液固定過夜。次日將第2、3、4片腦組織放入鏤空鋁盒中，以流動的水浸泡2 h 以上，依次經過梯度乙醇溶液脫水、二甲苯透明、浸泡石蠟，然后進行組織包埋及切片。石蠟切片在59～62 ℃烤箱內烘烤20 min后，進行常規脫蠟復水，依次為二甲苯1、二甲苯2、無水乙醇1、無水乙醇2、95%乙醇溶液、90%乙醇溶液、80%乙醇溶液、70%乙醇溶液、自來水浸泡5 min。復水后的腦組織經蘇木精染色5 min，用流動水沖洗10 min后，1%鹽酸乙醇溶液分化。再用流動的水沖洗10 min，使用伊紅染色25～35 s，梯度乙醇溶液脫水后中性樹膠封固。最后用光學顯微鏡觀察，并拍照。

1.8 統計分析

采用SPSS 26軟件進行數據統計分析。結果數據均用xˉ±s表示，組間比較采用獨立樣本均數t檢驗。以P＜0.05認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 彌漫性腦血栓模型大鼠腦組織滲出EB 含量增多

建模過程中兩組大鼠均未見死亡。與假手術組大鼠的腦組織中EB 含量（0.16±0.03 μg/g）比較，經花生四烯酸經頸內動脈注射建立的彌漫性腦血栓模型組 大鼠缺血側的EB 含量（0.25±0.10 μg/g）明顯升高，差異有統計學意義（n=6，P＜0.01）。兩組大鼠腦組織經EB染色后的拍照結果見圖2。

圖2 彌漫性腦血栓模型大鼠腦組織的依文思藍染色結果Figure 2 Evans blue（EB）staining images of brain tissue in rats with diffuse cerebral thrombosis

2.2 彌漫性腦血栓模型大鼠腦組織病理學變化

HE染色結果顯示，假手術組大鼠的腦組織細胞排列整齊，細胞間隙均勻，細胞形態完整，神經元形態完整，微血管腔無阻塞；與假手術組相比，模型組大鼠的腦組織細胞排列混亂，細胞間隙增大，細胞核皺縮，空泡細胞增多，神經細胞出現凋亡，個別微血管呈紅色條形的管型。圖3 是各組隨機選3 只大鼠的HE染色結果。

圖3 彌漫性腦血栓模型大鼠腦組織的HE染色結果（×40）Figure 3 HE staining of brain tissue in diffuse cerebral thrombosis model rats（×40）

3 討論

EB為偶氮基熒光染料，進入血液后與血漿白蛋白高度結合，正常情況下該結合物無法透過血腦屏障；當血腦屏障被破壞時，通透性升高，該結合物方可透過血腦屏障進入腦組織。腦損傷程度與血腦屏障通透性呈正相關，損傷越嚴重，血腦屏障的通透性越高，即EB透過的量越多，染藍程度越深。因此檢測腦組織中EB 滲出的含量可判斷腦損傷的程度［6-7］。HE 染色為經典的組織病理檢查方法［8］，操作簡單，結果可靠，其中伊紅染料可使不同形態的細胞因其成分不同呈現出深淺不一的粉紅色［9-10］。缺血性腦卒中發生后，腦組織細胞質濃縮紅染；神經細胞出現凋亡，排列紊亂，數量減少；細胞核皺縮、碎裂；微血管呈紅色條管型；細胞腫脹，可見膠質水腫，并出現凋亡，形成大量空泡細胞［11-12］。

相較于經典方法［3］，本研究有以下創新之處：（1）規定進行右側切口，較正中切口更便于頸總動脈、頸外動脈的分離，減少動物出血和對氣管的刺激，避免氣管痙攣和過多分泌物的產生，減少動物死亡率［5］。而且左側迷走神經直接分布于心臟，進行手術將影響心臟功能，于右側操作可減少不必要的腦外因素。（2）改進動物麻醉方式，采用異氟烷吸入麻醉代替戊巴比妥鈉麻醉，避免動脈收縮壓和平均動脈壓升高而造成動物心率降低，并在術中、術后對動物進行保溫，減輕呼吸及心臟功能抑制，降低死亡率。（3）改進花生四烯酸的保存方式，將花生四烯酸充氮氣密封存于－80 ℃冰箱，造模液（花生四烯酸-生理鹽水）現用現配，提高花生四烯酸的穩定性。（4）規范造模方式，用7～8周齡（體質量為250～300 g）的雄性SD大鼠實施手術。（5）用肝素-生理鹽水對手術引導管進行抗凝處理，防止血凝塊阻塞引導管。

本實驗結果顯示，較假手術組，模型大鼠缺血側出現彌漫性EB滲出量明顯增加（P＜0.01）；且缺血側腦組織細胞排列紊亂，部分皺縮，染色加深，空泡細胞增多，神經細胞出現凋亡。結果提示缺血側血腦屏障被破壞，大鼠彌漫性腦血栓模型復制成功，且模型大鼠死亡率低、穩定性好。

目前臨床腦血栓的發生受多因素、多途徑誘導，血管內皮細胞損傷與收縮、血小板活化與聚集、纖維蛋白凝固、血管壁炎性反應、斑塊的不穩定性增加、斑塊破裂、局部栓子形成等都與腦血栓的形成密切相關［13］。因此，用花生四烯酸誘導建立腦血栓模型適用于由血小板活化與聚集、血管內皮損傷導致的血栓栓塞性相關疾病的研究。